丛剑涵， 罗云敬*， 齐小花， 邹明强， 孔陈晨

1. 北京工业大学环境与生命学部， 环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室， 北京 100124

2. 中国检验检疫科学研究院， 北京 100123

引 言

尿酸(uric acid, UA)是人类系统中嘌呤核苷酸代谢的最终产物， 通常存在于生物液体如血清和尿液中， 并且由于尿酸的溶解性极低， 使其易于在人体内累积[1]。 尿酸过多积累会形成固体尿酸盐， 导致诸如高尿酸血症， 痛风性急性关节炎， 肾结石和高血压等疾病， 而血清中尿酸异常低可能会引发帕金森病或多发性硬化[2-3]。 此外， 尿酸作为一种替代性抗氧化剂， 能够清除细胞中氧自由基， 从而使其在许多生理病理和损害发生中起到潜在的神经保护作用[4]。 人体在健康的生理状态下体内尿酸的含量相对稳定， 男性150～420 μmol·L-1， 女性90～357 μmol·L-1， 但在病理状态下， 其含量会发生明显波动。 因此， 血清中尿酸的测定是临床检测中最重要的生化指标之一， 开发一种具有高度选择性， 高灵敏， 高效的尿酸检测方法具有重要意义。

目前， 尿酸的测定方法主要包括高效液相色谱， 质谱， 紫外分光光度， 电化学， 化学发光和毛细管电泳法[5-10]。 Ma等[10]开发了一种毛细管电泳法测定体液中尿酸。 Liu等[11]通过高效液相色谱-质谱联用技术同时测定人唾液中尿酸和肌酐。 陆娟等[12]采用静电纺丝法制备了碳量子点@纳米Co3O4生物传感器检测人血清中的尿酸。 然而上述方法普遍存在繁琐的衍生、 修饰和复杂的前处理等问题， 且仪器价格昂贵、 成本高和特异性低， 限制了其在临床试验中尿酸检测的潜在应用。 作为一种新型的纳米材料， AuNCs荧光探针具有操作简单、 快速、 灵敏度高的优点。 由于其良好的光学性能， 光稳定性和生物相容性， 以及其简单且无毒的制备方法[13]， 在临床样品检测中具有广阔的应用前景。

本文以BSA为模板分子成功制备了BSA-AuNCs荧光探针， 并基于尿酸酶促反应产物H2O2对BSA-AuNCs荧光探针的猝灭效应， 开发了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的超灵敏生物传感器检测尿酸。 由于强荧光的BSA-AuNCs和氧化态的ox-TMB之间有效的FRET， 使得该方法简便快速， 灵敏度高。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O， 国药控股有限公司)； BSA(纯度>98%， 美国Amresco公司)； H2O2(30%分析纯， 北京化工厂)； TMB， UA， Urate Oxidase(纯度>98%， 上海麦克林生化科技有限公司)； NaOH， Na2HPO4， NaH2PO4， Citric acid(分析纯， 国药控股有限公司)； 实验用水为超纯水(电导率>18 MΩ·cm)。

SH-3恒温磁力搅拌器(北京金科发展公司)； PHS-25数字pH计(上海精密科学仪器公司)； JEM-2100 透射电子显微镜(日本)； U-3010紫外-可见分光光度计(UV， HITACHI日立)； F-4500 荧光分光光度计(FL， HITACHI日立)； Labofuge 400R离心机(美国Thermo公司)。

1.2 基于BSA-AuNCs荧光探针的合成方法

由BSA合成的AuNCs作为生物学模板参考以前的方法[14]， 将125 mg BSA加入到2.5 mL超纯水中， 于37 ℃水浴中搅拌至溶解， 在剧烈搅拌下迅速向BSA溶液中加入HAuCl4水溶液(10 mmol·L-1， 2.5 mL)混匀5 min后， 加入NaOH溶液(1 mol·L-1， 0.25 mL)， 在37 ℃下温和搅拌24 h。 所得BSA-AuNCs溶液的颜色从浅黄色变为浅棕色， 最后变为深棕色。 然后， 将获得的溶液在黑暗中静置24 h， 之后倒入20 000 MWCO透析袋中透析24 h(每8 h更换一次水)， 以除去未反应的小分子HAuCl4和NaOH。 将透析后的混合溶液用注射器经过0.22 μm的微孔滤膜过滤除去多余的大粒径的杂质。 最终将获得的溶液在黑暗中于4 ℃下保存。

1.3 BSA-AuNCs荧光探针的表征

荧光探针的形貌通过高分辨场发射透射电镜(TEM)进行测试。 然后分别测试探针的紫外-可见光谱和荧光光谱， 并分别确定所有测试条件在5和10 nm下的激发和发射狭缝宽度。 实验的pH值采用20 mmol·L-1柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液控制。 经37 ℃温水浴中适当温育后， 在UV和FL上分别记录紫外吸收光谱和荧光光谱以定性。

1.4 基于FRET生物传感器的建立

依次将100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 700 μL 20 mmol·L-1柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)、 100 μL 5 mmol·L-1TMB溶液和100 μL 2 mmol·L-1H2O2溶液于1.5 mL离心管中混匀， 将混合溶液在37℃温水浴中温育15 min后， 在UV上测量ox-TMB吸收光谱， 在FL上测量荧光光谱。

1.5 H2O2的荧光猝灭检测

1.6 荧光猝灭检测UA

配制20 mmol·L-1UA储备液， 用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液稀释UA储备液至不同浓度， 将700 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0， 20 mmol·L-1)、 100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 100 μL 5 mmol·L-1TMB溶液、 15 μL尿酸酶(10 mg·mL-1)和不同浓度的UA在37 ℃黑暗中温育15 min。 然后用FL以500 nm激发波长记录荧光光谱。

1.7 用该方法对血液样本进行分析

首先将血样(来自3名健康志愿者)， 以3 500 r·min-1离心5 min， 去除部分沉淀物， 以消除蛋白质可能对人血清的干扰， 获得浅黄色血清。 随后， 将一定体积的上层血清样品与10 mg·mL-1的尿酸酶在37 ℃下温育10 min， 然后取100 μL上述氧化后的溶液与700 μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0， 20 mmol·L-1)， 100 μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、 100 μL 5 mmol·L-1TMB溶液混合摇匀， 在37 ℃黑暗中温育15 min。 最后， 在FL上进行血清中UA的分析。

2 结果与讨论

2.1 BSA-AuNCs荧光探针的表征

BSA-AuNCs的TEM图像如图1所示， BSA-AuNCs是单分散的， 呈圆球形且分布均匀， 最小粒径0.86 nm， 最大粒径3.00 nm， 粒径平均直径为1.86 nm。 图2显示了BSA-AuNCs的UV-Vis吸收光谱、 荧光激发和发射光谱以及HAuCl4和BSA的UV-Vis吸收光谱。 曲线1显示BSA-AuNCs在275 nm附近具有强吸收峰， 曲线2和曲线3分别是HAuCl4和BSA的UV-Vis吸收曲线， 由图2可知， 三者UV-Vis吸收光谱明显不同。 当在500 nm激发时， BSA-AuNCs发射峰出现在617 nm。 插图显示在紫外灯365 nm的激发下， 深棕色的BSA-AuNCs溶液发出强烈的红色荧光。 上述结果与文献[14-15]相似， 表明成功地制备了BSA-AuNCs荧光探针。

图1 BSA-AuNCs的TEM； 插图为BSA-AuNCs粒径分布图

图2 BSA-AuNCs(1)； HAuCl4(2)； BSA(3)的紫外吸收光谱； BSA-AuNCs的荧光激发光谱(4)和发射光谱(5)； 插图为BSA-AuNCs在日光和365 nm紫外灯下的照片

2.2 FRET生物传感器增强荧光猝灭

BSA-AuNCs的良好稳定性归因于被模板分子完全包裹的金核的化学惰性。 从而使其在FRET中的应用成为可能， 如图3(a)所示， 在BSA-AuNCs和TMB存在下加入H2O2， 此时BSA-AuNCs显示出固有的过氧化物酶活性， 在没有BSA-AuNCs的情况下， H2O2几乎不能氧化TMB。 在654 nm处显示为无色溶液且无明显吸收[图3(a)， 1]， 在BSA-AuNCs-TMB[图3(a)， 2]和BSA-AuNCs-H2O2[图3(a)， 3]中发现了相同的结果， 然而， 当将BSA-AuNCs引入H2O2和TMB溶液中时， 它可以催化H2O2将TMB氧化为ox-TMB。 ox-TMB在654 nm处出现最大吸收光谱并且获得明显的蓝色溶液[图3(a)， 4]。 如图3(b)由于BSA-AuNCs的发射光谱和ox-TMB的最大吸收光谱重叠， 证明他们之间存在FRET的可能， 插图显示， 可见光下， 在BSA-AuNCs催化下TMB被氧化前后， 颜色从无色变为蓝色。 因此， 该传感系统产生了双光信号的变化。

图3 不同组分溶液的紫外-可见吸收光谱 (1) TMB+H2O2; (2) BSA-AuNCs+TMB; (3) BSA-AuNCs+H2O2; (4) BSA-AuNCs+TMB+H2O2; 插图显示相应组分溶液的照片(a); BSA-AuNCs的发射光谱和ox-TMB的紫外吸收光谱； 插图为BSA-AuNCs催化H2O2氧化TMB前后颜色变化对比照片(b)

引入TMB进行荧光检测， 当BSA-AuNCs中仅存在TMB时， 不会改变其荧光强度和吸收[图4(2)]， 加入一定量H2O2时， 测量荧光值略有降低， 并能保持荧光值数小时无明显波动[图4(3)]。 然而将TMB与H2O2和BSA-AuNCs共同作用时， 其荧光强度迅速降低， 且较单独加入H2O2时显示出荧光猝灭明显增强， 这比不含TMB的H2O2样品直接检测要明显得多[图4(4)]。 这是由于BSA-AuNCs和ox-TMB之间的内部过滤作用， BSA-AuNCs和ox-TMB分别作为FRET的供体和受体， 在能量转移过程中， 受体ox-TMB在BSA-AuNCs发射区域表现出较强的吸收， 使得供体BSA-AuNCs的荧光强度被显著猝灭。 因此， 基于FRET的分析方法具有灵敏度高， 可视化等优点， 证明了这是一种超灵敏荧光传感器。

图4 不同BSA-AuNCs样品的荧光光谱

2.3 FRET生物传感器辅助荧光猝灭系统的优化

为了获得更高的H2O2和UA的检测灵敏度， 我们考虑了各种可能的影响因素， 包括溶液酸度、 离子强度、 培养温度和时间， 对实验条件进行了优化。

2.3.1 pH的影响

为做好政府与群众的联系纽带，该中心积极回应百姓需求，自2011年7月27日成立以来，共受理各类食品药品安全问题咨询和投诉举报达36余万件，受理量年均增长30%，举报查实率近70%，平均办结时间19天，群众诉求100%得到回复。2014年，中心开通语音留言功能，落实专人回听，并在非高峰时段进行受理，全年“额外”受理市民投诉举报6936件，占全年电话受理总量的10.6%。2015年初，中心接到大量求购“苯巴比妥片”的电话后及时上报，同年4月，该药品恢复生产供应。中心逐一告知来电人恢复供药的信息及就近购药地点，得到市民广泛好评。

考察了不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液对BSA-AuNCs在检测中荧光强度的影响， 如图5(a)， 结果表明： 当BSA-AuNCs溶液在pH(6.0～8.0)范围内对H2O2的相对强度(F0/F)略有变化， 其中F0和F分别是在不存在和存在H2O2和TMB的情况下BSA-AuNCs的荧光强度， 考虑到进一步的生物学应用和最佳的检测效果， 我们选择了pH6.0作为最佳酸度。

2.3.2 离子强度的影响

离子强度是光谱检测方法中的一个重要影响因素， 在这项工作中， 我们使用NaCl来控制离子强度， 以研究荧光猝灭的效果， 如图5(b)， 随NaCl浓度(0， 2.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0， 80.0， 100.0， 120.0， 150.0， 153.8 mmol·L-1)的增加， BSA-AuNCs对H2O2的荧光响应没有明显变化， 表明我们的方法可以在正常生理盐浓度中进行。

2.3.3 温度的影响

如图5(c)所示， 实验测试了温度对FRET辅助荧光猝灭系统的影响， 当温度从25 ℃上升到60 ℃时， 在25～37 ℃时，F0/F逐渐升高， 当温度到达37 ℃时， 达到最佳状态， 温度由37 ℃变化到60 ℃时，F0/F略有降低， 因此， 这里我们采用37 ℃的生理温度作为最佳检测条件。

2.3.4 反应时间的影响

在动力学研究中， 为了检测BSA-AuNCs对H2O2相对荧光强度随时间的变化， 对反应时间进行了动态检测， 如图5(d)所示， 显示在BSA-AuNCs溶液中加入TMB和H2O2后， 反应时间5～80 min呈动态猝灭， 发现荧光强度在开始的15 min内几乎呈线性且显著下降， 然后保持恒定。 因此， 采用15 min作为最佳反应时间， 与不加入TMB应用BSA-AuNCs荧光探针直接检测H2O2需70 min时相比， 大大缩短了反应时间。

图5 pH(a)， 离子强度(b)， 温度(c)， 反应时间(d)对荧光的影响， 含50 μmol·L-1 H2O2， 5 mmol·L-1 TMB的BSA-AuNCs

在最佳条件下， 不同H2O2浓度下BSA-AuNCs的荧光强度， 如图6(a)所示， 随H2O2浓度(0， 0.02， 0.5， 2.5， 7， 9， 12， 15， 20， 25， 50， 80 μmol·L-1)的变化， BSA-AuNCs的荧光强度逐渐被猝灭， 如图6(b)所示， H2O2对BSA-AuNCs在0.5～20 μmol·L-1范围内的猝灭程度(F0-F)/F0线性相关， 线性回归方程为(F0-F)/F0=0.025 83cH2O2+0.095 12， 线性相关系数为0.994 5。 H2O2的检出限为0.07 μmol·L-1， 表明H2O2具有较低的检测限。 比不用FRET生物传感器辅助荧光猝灭系统检测H2O2样品(检出限6.6 μmol·L-1)低近两个数量级[16]。 因此， 基于FRET的传感器具有灵敏度高， 检测限低， 可视化的优点， 大大提高了其检测性能， 为进一步灵敏地检测UA提供了基础。

图6 BSA-AuNCs对不同量的H2O2和TMB共存的荧光光谱图(a)； 线性关系Stern-Volmer图(b)

2.4 UA的检测

基于以上的检测结果， 我们已经建立了一种对H2O2的灵敏、 可视化的检测方法。 由于H2O2是一系列特定底物氧化酶的酶促反应产物， 因此H2O2的灵敏检测可以扩展到生物催化过程的应用中。 尿酸氧化酶在UA的存在下催化和氧化UA生成H2O2， 尿囊素(Allantoin)和二氧化碳(CO2)。 基于FRET法灵敏检测UA如示意图1所示。

示意图1 BSA-AuNCs荧光探针基于FRET检测H2O2和UA的示意图

结果显示， 当添加TMB后， 在检测UA的酶促反应产物时， 显示出荧光猝灭较UA单独存在时增强， 如图7(a)所示， 随UA浓度(0， 0.7， 2.0， 15， 40， 65， 70， 80， 100， 150， 200 μmol·L-1)的增加， BSA-AuNCs的荧光强度持续降低， 并且研究了仅向BSA-AuNCs中添加UA或尿酸氧化酶不会引起其荧光强度的变化。 而当UA和尿酸氧化酶同时存在时， BSA-AuNCs的荧光发生猝灭， 这表明BSA-AuNCs的荧光强度降低是由于尿酸氧化酶催化尿酸产生H2O2引起的。 在尿酸氧化酶存在下， 不同浓度的UA与BSA-AuNCs反应的相对强度(F0-F)/F0， 如图7(b)所示， 其中F0和F分别是不存在UA和存在UA的荧光强度， 结果发现， 在2.0～100 μmol·L-1范围内， 猝灭程度呈良好线性关系， 表示为(F0-F)/F0=0.005 85cUA+0.103 64， 线性相关系数为0.995 4， 检出限为0.26 μmol·L-1。 远低于人体正常尿酸含量的最低值(90 μmol·L-1)。 因此， 设计的FRET， 灵敏传感器在检测UA方面优于以前的报道[16-17]， 显示了高灵敏度和低检测限的优势。 为其进一步应用于临床血样的检测提供了基础。

图7 BSA-AuNCs对不同量的UA和TMB共存的荧光光谱图(a)； 线性关系Stern-Volmer图(b)

2.5 BSA-AuNCs的选择性评估

为了证明我们设计的灵敏传感器的选择性， 还研究了一些其他潜在干扰物对BSA-AuNCs的响应， 实验是在最佳检测条件和10 mg·mL-1尿酸氧化酶存在下进行的， UA的浓度为50 μmol·L-1， 干扰物质BSA， 谷胱苷肽(GSH)， 抗坏血酸(Vc)， 柠檬酸(CA)， 尿素(Urea)， 葡萄糖(Glu)， 甘氨酸(Gly)， 酪氨酸(Tyr)， 氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)的浓度为5 mmol·L-1， 结果如图8， 上述干扰物质中仅Vc提供了较小的荧光增强， 除此之外其他物质存在下BSA-AuNCs的荧光强度几乎保持恒定， 仅当存在UA时， 荧光才显著猝灭。 这归因于尿酸氧化酶的高催化活性和对UA的高特异性， 结果表明， 所提出的灵敏UA检测方法具有高选择性。

图8 UA的潜在干扰物对BSA-AuNCs荧光探针的影响

2.6 临床血液样本的分析

由于该方法具有的高灵敏度、 高度选择性和高特异性， 因此将本方法应用于实际临床血样中UA的测定， 结果如表1， 采用标准加样回收的方法检测血样中的UA， 加标回收率为97.3%～104.7%， 相对标准偏差RSD为2.4%～3.2%， 表明此方法可以应用于临床血液样本中UA的灵敏检测。

表1 血液样本UA回收率结果

3 结 论

以BSA作为模板分子， 以简单、 绿色的方法合成了BSA-AuNCs荧光探针， 基于超灵敏的FRET多功能生物传感系统检测H2O2和UA， BSA-AuNCs在这里显示出特征性的过氧化物酶活性， 在检测中催化H2O2氧化TMB， 从而生成ox-TMB。 强荧光的BSA-AuNCs和ox-TMB之间有效的FRET使得对H2O2和UA的检测限极低， 分别为0.07和0.26 μmol·L-1， BSA-AuNCs催化的过氧化物酶底物TMB生成ox-TMB的颜色变化可以更直观的观察到实际样品中的UA。 与之前的方法相比， 本方法操作简单， 快速， 具有较高的灵敏度和选择性且可视化， 此方法用于测定临床实际血样中UA的浓度， 获得了较为满意的结果， 有望应用于临床实际样品中UA的快速、 灵敏和高特异的检测。 本研究设计的FRET传感器在这里显示出灵敏度高， 检测限低等优点， 大大提高了UA酶促反应产物H2O2的检测性能， 使得该方法有助于实现其他特定酶促反应产物的快速筛查分析。