王文，许时贵，付志媛，魏鑫华，张国松

1.江西省皮肤病专科医院，江西省皮肤病临床医学研究中心，国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心分中心建设单位，江西 南昌 330001；2.江西中医药大学，江西 南昌 330006

白斑酊收载于南京市卫生局主编的《医院制剂规范》［1］，为临床经验方，由补骨脂、菟丝子、栀子3 味中药以1∶1∶1 的比例构成，主要用于治疗白癜风［2-3］、皮肤白斑等。该处方在临床上使用多年。使用本品时，需将相同重量的3 味药材用适宜浓度的乙醇浸渍7～10 d 后方可使用，且浸渍时间长，操作烦琐，患者依从性差。而且由于患者操作水平的不同，造成工艺不稳定，药品的质量得不到保证，影响药物疗效。本研究根据白斑酊处方组成、有效成分的性质，保持原剂型（酊剂）不变的情况下，使用单因素考察结合Box-Behnken 设计-响应面法进行实验，优化浸渍工艺，在保证原组方中治疗疾病的物质基础未发生变化的情况下优化了制剂生产工艺，保证了制剂的稳定、安全、有效。

1 仪器和试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪（配备紫外检测器，四元梯度泵，安捷伦数据处理软件系统）。补骨脂素对照品（批号110739-200814）、异补骨脂素对照品（批号110738-200511）、栀子对照药材（批号120986-201108）、栀子苷对照品（批号110749-200714）均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法和结果

2.1 浸渍工艺研究

2.1.1 补骨脂素和异补骨脂素含量测定方法补骨脂为该处方的君药，是治疗白癜风常用的中药。其主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素，具有较强镇静、解痉、止血等作用，是补骨脂治疗白癜风的有效成分［4］。实验以补骨脂素和异补骨脂素总转移率为指标，进行浸渍工艺研究。

（1）色谱条件和系统适用性条件。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（50∶50）；检测波长：246 nm；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃。理论板数按补骨脂素峰计算不低于3 000。

（2）溶液制备。混合对照品溶液的制备：取补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含补骨脂素14.0 μg 和异补骨脂素16.4 μg 的混合溶液，即得；供试品溶液制备：精密量取浸渍液1 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

（3）测定法。分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪，测定。

（4）阴性对照溶液的制备。处方中除去补骨脂的其余药味按制剂工艺制备，制得供试品阴性对照，照供试品溶液制备的方法制得供试品阴性对照溶液。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液与阴性对照溶液各10 μL，按上述色谱条件测定，结果阴性对照溶液色谱在与对照品溶液色谱和供试品色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性良好，结果如图1 所示。

图1 高效液相色谱图：A.供试品溶液；B.混合对照品溶液；C.阴性对照溶液

（5）线性范围考察。精密吸取混合对照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL（分别含补骨脂素对照品0.028 μg、0.070 μg、0.112 μg、0.140 μg、0.210 μg、0.280 μg 和异补骨脂素对照品0.033 μg、0.082 μg、0.131 μg、0.164 μg、0.246 μg、0.328 μg）分别注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）对补骨脂素和异补骨脂素进样量（X）进行回归，得标准曲线。补骨脂素线性方程为：Y=8 985.5X-2.142 9，r=1.000 0；异补骨脂素线性方程为：Y=10 585X-4.643 7，r=1.000 0。表明补骨脂素和异补骨脂素在各自进样量范围内与峰面积线性关系良好。

（6）精密度试验。精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6 次,测得补骨脂素对照品峰面积平均值为1 257.25，RSD 为0.17%；测得异补骨脂素对照品峰面积平均值为1 732.97，RSD 为0.18%，说明该方法精密度良好。

（7）稳定性试验。取供试品溶液10 μL，按拟定的含量测定项下方法分别在0、2、4、8、16、24 h 测定，结果补骨脂素峰面积平均值为699.07，RSD（n=6）为0.53%；异补骨脂素峰面积平均值为604.86，RSD（n=6）为0.49%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

（8）重复性试验。按拟定的含量测定方法，取同一批样品平行制备6 份供试品溶液，测得补骨脂素峰面积平均值为696.88，RSD（n=6）为0.66%；异骨脂素峰面积平均值为600.74，RSD（n=6）为0.20%，表明方法重复性良好。

（9）加样回收率试验。取已知含量的样品（补骨脂素和异补骨脂素含量分别为0.389 0 mg/mL、0.286 0 mg/mL）1 mL，精密加入补骨脂素对照品和异补骨脂素对照品混合溶液1 mL(补骨脂素浓度为0.392 2 mg/mL、异补骨脂素浓度为0.300 5 mg/mL)，按供试品制备与测定方法，平行做6 份，计算得补骨脂素回收率为101.75%，RSD 为0.63%；异补骨脂素回收率为101.21%，RSD 为0.36%，结果见表1、表2。说明该方法准确度良好。

表1 补骨脂素回收率测定结果

表2 异补骨脂素回收率测定结果

（10）补骨脂药材含量测定。取补骨脂药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2 h，放冷，转移至100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取10 μL 进样，测得药材中补骨脂素和异补骨脂素的总含量为1.26%。

2.1.2 单因素考察白斑酊处方为：补骨脂60 g、菟丝子60 g、栀子60 g。

（1）原料粉碎粒度。称取处方饮片3 份，分别粉碎，过20 目、30 目、40 目筛，70%乙醇料液比9∶40，浸渍7 d，按上述方法测得浸渍液中补骨脂素和异补骨脂素总转移率分别为43.37%、57.21%、68.35%。结果表明，随着粉碎粒度增加，总转移增加，确定粉碎过筛目数为40 目。

（2）浸渍温度。称取处方饮片3 份，粉碎，过40 目筛70%乙醇料液比9∶40，分别在20℃、30 ℃、40℃条件下浸渍7 d，按上述方法测得浸渍液中补骨脂素和异补骨脂素总转移率分别为65.25%、65.38%、66.21%。结果表明，随着浸渍温度升高，总转移无明显变化，说明浸渍温度对浸渍工艺的影响差异无统计学意义。

（3）乙醇浓度。称取处方饮片5 份，粉碎过40 目筛，用浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%乙醇800 mL 浸渍7 d，按上述方法测得浸渍液中补骨脂素和异补骨脂素总转移率分别为43.25%、62.03%、68.35%、68.56%、69.03%。结果表明，随着乙醇浓度的升高，总转移率升高，在60%后总转移率基本不再增加，故乙醇浓度以60%、70%、80%为考察对象。

（4）料液比。称取处方饮片5 份，粉碎过40目筛，分别用500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL 70%浓度的乙醇浸渍7 d，即料液比为9∶25、9∶30、9∶35、9∶40、9∶45，按上述方法测得浸渍液中补骨脂素和异补骨脂素总转移率分别为43.13%、51.08%、68.55%、72.98%、78.25%。结果表明，随着料液比的升高，总转移率增加，在料液比9∶35 后总转移率基本不再增加，故料液比以9∶35、9∶40、9∶45 为考察对象。

（5）浸渍时间。称取处方饮片4 份，粉碎过40目筛，分别用700 mL 的70%浓度的乙醇浸渍5、7、9、11 d，按上述方法测得浸渍液中补骨脂素和异补骨脂素总转移率分别为48.26%、68.55%、71.27%、72.43%。结果表明，随着浸渍时间的增加，总转移率增加，在7 d 后总转移率基本不再增加，故浸渍时间以7、9、11 d 为考察对象。

2.1.3 Box-Behnken 设计-响应面法优化浸渍工艺（1）响应面试验设计与结果。在单因素实验基础上，原料粉碎过筛目数固定为40 目，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、浸渍时间（C）为自变量，每个自变量的低、中、高水平以-1、0、1 进行编码，以补骨脂素和异补骨脂素总转移率%（Y）为响应值，使用Design-Export.V12 软件进行Box-Behnken 中心点试验设计［5］，因素水平及编码见表3，实验安排及结果见表4。

表3 试验因素水平

表4 响应面设计与结果

利用ANOVA 分析响应面回归参数，采用Design-Export.V12 软件对表6 数据进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程Y=77.26+2.47A+5.21B+2.44C+2.79AB-0.1975AC-0.57BC-3.27A2+3.04B2-4.58C2

（2）方差分析。经过软件分析，模型的F=5.91，P=0.014 3（P＜0.05），R2=88.38%，说明该模型拟合结果较为理想。通过分析A（乙醇浓度）、B（料液比）、C（浸渍时间）三因素对补骨脂素和异补骨脂素总转移率的影响顺序为B＞A＞C，其中，B 对结果的影响差异有统计学意义（P＜0.05）。各因素交互影响的顺序为AB＞BC＞AC，但其对结果影响差异无统计学意义（P＞0.05）。除了B 外，其他因素对该模型的影响差异无统计学意义（P＞0.05），证明各项因素与补骨脂素和异补骨脂素总转移率不是简单的线性关系。失拟态F=5.95，P=0.087 3，表明无失拟因素存在。方差分析结果详见表5。

表5 方差分析结果表

（3）浸渍工艺的响应面结果分析。根据实验结果，进行回归分析后，作出响应曲面图，如图2 所示。使用Design-Export.V12 对浸渍工艺的相关参数进行优化，根据模型拟合结果，白斑酊浸渍工艺为加74.93%乙醇，料液比9∶45，浸渍9.28 d，此条件的总转移率的预测值为87.463%。结合实际操作的可行性和简便性，最终确定了其最佳浸渍工艺，70%乙醇，料液比9∶45，浸渍9 d。

图2 ABC三因素对总转移率的响应面图

2.1.4 验证实验为了验证优化后工艺（70%乙醇，料液比9∶45，浸渍9 d）的可靠性及稳定性，按处方比例，称取药材3 份，每份180 g，按优化后工艺条件浸渍，按上述含量测定方法测定补骨脂素和异补骨脂素总量，计算补骨脂素和异补骨脂素总转移率，结果见表6。

表6 工艺验证结果表

结果表明，3 份验证样品的补骨脂素和异补骨脂素平均总转移率为88.18%，工艺参数稳定。

2.2 白斑酊的质量标准研究

2.2.1 薄层色谱鉴别（1）方中补骨脂的薄层色谱鉴别，参考《中国药典》2020 年版一部补骨脂【鉴别】项下方法及文献资料对方中补骨脂进行鉴别［6-7］，以补骨脂素对照品和异补骨脂素对照品混合液为对照，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰且对应良好，阴性无干扰（如图3 所示）。

图3 补骨脂薄层色谱（365 nm）

（2）方中栀子的薄层色谱鉴别，参考《中国药典》2020 年版一部中栀子【鉴别】项下的薄层色谱方法进行鉴别［6］。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰且对应良好，阴性无干扰（如图4 所示）。

图4 栀子薄层色谱显色图

2.2.2 含量测定取白斑酊的3 批中试产品同“2.1.3”项下补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法制备，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，按色谱条件测定。结果：白斑酊的3 批中试产品的补骨脂素和异补骨脂素总含量分别为：0.677 9 mg/mL、0.678 7 mg/mL、0.677 8 mg/mL。

3 讨论

本次实验以补骨脂素和异补骨脂素的总转移率为指标，使用单因素考察结合Box-Behnken 设计-响应面法考察了白斑酊的最佳浸渍工艺，对其中的补骨脂及栀子进行了薄层色谱鉴别，并检测了酊剂中补骨脂素和异补骨脂素总含量，为白斑酊品种的开发提供了依据。