关桦楠，孙艺铭，张 悦，刘晓飞

哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076

黄酮类化合物是一种酚类化合物，到目前为止，已经鉴定出近6 000种，而且数量还在不断增加。它们与其他芳香族化合物的不同之处在于C6—C3—C6的结构由两个苯环(A和B)组成，通过C3连接器(杂环吡喃环C)互连。根据连接体C3的不饱和度和氧化状态的不同，黄酮类化合物可分为黄酮类、二氢黄酮类和异黄酮类等。最常见的黄酮类化合物包括橙皮素和柚皮素(黄烷酮)，芹菜素(黄酮类)，异鼠李素、山柰酚和槲皮素(黄酮醇)[1]。因其结构的特殊性，黄酮类化合物显示出一系列潜在的有益生物活性，包括抗病毒[2]、抗氧化[3]、降低胆固醇和抗癌等作用[4-6]。黄酮类化合物也被用作功能性成分，用于各种食品、药物。一方面，大多数食用植物中的黄酮类化合物以O—糖苷的形式存在，其中含有与酚羟基相连的糖，如葡萄糖、鼠李糖[7-8]，在极少数情况下，糖直接与碳骨架结合，如C—葡萄糖苷黄酮。另一方面，黄酮类化合物主要以聚合物或苷元的形式存在于植物种子中。综上所述，黄酮类化合物在食品和药品的开发利用中展现出了广阔的前景，为提高社会效益及经济效益提供了可能[9]。

植物蛋白来源广泛、价格低廉，通常存在于谷物、坚果和豆科类植物之中，某些干豆类食品中蛋白质含量可高达40%左右。因植物蛋白潜在的健康益处以及对环境的积极影响，已经越来越受到研究人员和消费者关注[10]。同时也越来越多地被开发为功能性食品成分，如蚕豆蛋白已经作为天然乳化剂用于制备基于乳液的输送系统[11]。

在食品生产、加工及贮藏的过程中，黄酮类物质和蛋白质相互作用是大多数食品系统中自然发生的现象，二者相互接触，利用黄酮与蛋白质的亲和力，形成植物蛋白-黄酮聚集体[12]。例如米糠-蛋白质-儿茶素复合物是一种有效的乳化剂，能够在高压均质过程中形成小油滴[13]。而二者之间的相互作用会导致蛋白质的溶解度、热稳定性、消化率及空间结构变化，复合物的形成也可能导致蛋白质的营养价值、酶活性和其他生物效应变化[14]。

为了更好地识别结合过程中发生的现象，对植物蛋白-黄酮复合物进行更深入的研究，作者综述了近年来植物蛋白-黄酮相互作用机制的最新研究成果，总结了关于植物蛋白与黄酮相互作用的分析技术及对食品中蛋白质和黄酮功能特性改善的研究进展，以期为扩大植物蛋白-黄酮相互作用在食品加工领域的应用提供参考依据。

1 植物蛋白-黄酮的相互作用机制

在食品加工过程中，植物蛋白与黄酮的相互作用不可避免，二者相互作用通常导致可溶或不可溶聚集体的形成。这些聚集体的形成涉及蛋白质和黄酮的芳香基团的疏水堆积，或者黄酮类物质的—OH基团和蛋白质链的相互作用。黄酮与蛋白质的结合会导致蛋白质结构的展开，也会影响这两种成分的生物利用度并使混合体系内部微观结构形态变化，进而对食品体系的理化性质造成一定影响。因此，对植物蛋白与黄酮相互作用的研究已经成为时下热门之一。具体围绕植物蛋白-黄酮复合物的共价相互作用和非共价相互作用两种作用类型进行综述。

1.1 共价相互作用

黄酮和蛋白质之间的共价键可以诱导蛋白质交联。黄酮类物质由于其特殊的化学结构及较强的化学反应性，极易通过酶促反应或碱诱导、pH值诱导和自由基诱导等非酶促反应被氧化。当黄酮暴露于氧气、氧化剂(过氧化氢)存在的环境条件下，可以显著地促进共价键的形成[15]，从而不可逆地将黄酮与蛋白质连接起来。在氧气存在的条件下，黄酮自动与氧气结合，发生自氧化反应。自氧化反应涉及两步电子转移过程，如图1所示。首先，电子从黄酮转移到氧气形成邻半醌自由基。邻半醌自由基是一种不稳定的化合物，可以通过自由基反应生成邻醌和重组的母体分子，也可以与分子氧发生反应，产生超氧阴离子自由基。随后，超氧阴离子自由基被母体黄酮清除，并再次产生邻半醌自由基和过氧化氢。这种氧化还原循环会不断持续，直到系统的氧气被耗尽。与单电子转移相比，来自母体分子的两步电子转移产生了更多的热力学稳定的邻醌。邻醌形成后迅速异构化为对醌甲酰胺中间体。作为有效的亲电试剂，醌与蛋白质的巯基、胺、酰胺、吲哚或咪唑等氨基酸的亲核基团特异性地、不可逆地结合，进而形成黄酮-蛋白共价复合物。此外，黄酮-蛋白质共价复合物也可以通过自由基介导的过程形成。通过自由基(如羟基自由基)攻击形成的蛋白质自由基可以在黄酮类物质羟基的邻位或对位发生共价结合以合成黄酮-蛋白质共价复合物。自由基介导形成的黄酮-蛋白质共价复合物显示出更好的稳定性和生物活性[16]。

图1 醌形成后槲皮素与蛋白质游离氨基的反应Fig.1 Reaction of quercetin with free amino group(s) of protein(s) after quinone formation

1.2 非共价相互作用

非共价相互作用也称为可逆相互作用，多发生于温和条件下。黄酮和蛋白质通过氢键、疏水吸引和其他相互作用[17]连接在一起。对于氢键，发生在蛋白质的H受体位点和多酚的羟基之间。黄酮是优秀的氢供体，能有效地与蛋白质的羧基形成氢键。疏水相互作用是通过蛋白质的疏水化学物质与黄酮类物质的芳香环相互作用实现的。黄酮和植物蛋白之间的3D对接模式和活性位点的氨基酸如图2a、2b所示，蛋白质受体的疏水表面与黄酮相互作用，红色和蓝色分别代表疏水性和亲水性。如图2c所示，二者相互作用时，黄酮自身插入蛋白质表面的空腔中，并与一些氨基酸残基相互作用。原花青素(PB2)的存在降低了水稻蛋白质的α-螺旋结构，并降低了其表面疏水性，提高了PB2的抗氧化活性[18]。Ye等[19]发现芦丁和大豆分离蛋白之间存在着相互作用，并证实了这种相互作用是疏水相互作用。富含羟基的黄酮在蛋白质中表现出更多的结合位点，且黄酮的加入改变了原蛋白质的二级结构，进而影响了复合物的抗氧化活性等功能特性[20]。其他相互作用包括蛋白质带正电基团(如赖氨酸的ε-氨基)和黄酮带负电羟基之间的离子键等，但是它们在黄酮-蛋白质相互作用中似乎作用不大。

注：图a、图b为对接模式和活性位点的氨基酸；图c为相互作用过程。图2 原花青素与大米谷蛋白疏水相互作用[18]Fig.2 Hydrophobic interaction diagram between PB2 and RG[18]

2 植物蛋白-黄酮相互作用的分析方法

为了探索黄酮和蛋白质之间的相互作用以及复合物的性质，从分子水平上理解该体系，需要对黄酮-蛋白质系统进行更深入研究，并确定其结合亲和力、结合能、构象变化、动力学常数和聚集形式等信息。现如今，已有多种技术被用于分析黄酮与蛋白分子间的相互作用并建立了许多测定相互作用的方法，它们主要是基于光谱测量[21]。然而，显微镜、热力学、电泳、色谱和生物信息学分析也可用于评估植物蛋白-黄酮复合物的形成。

2.1 紫外-可见吸收光谱

紫外-可见吸收光谱法是一种相对简单且广泛应用的技术，用于探索蛋白质的结构变化及其复合物的形成[22-23]。蛋白质及黄酮类化合物均在紫外可见光谱范围内具有吸收峰。当黄酮类物质与蛋白质发生动态或静态结合时，分子体系会发生变化，根据吸收峰位置、峰宽等变化可以进一步分析二者结合的机理。Zhang 等[24]应用紫外-可见光谱对麦谷蛋白和木樨草素相互作用进行表征分析，研究发现紫外-可见光谱出现增色和蓝移。这是由于二者之间的相互作用可以影响蛋白质的结构，从而导致电子跃迁或能级差异的变化。

2.2 荧光光谱

荧光光谱法由于操作简单、易于获取和准确等特点，成为分析黄酮与蛋白质结合亲和力的热点技术。许多研究小组已经使用荧光技术来研究蛋白质与小分子(如黄酮、表面活性剂等)的结合[25]。蛋白质被认为是具有内在发射荧光的物质，这主要是由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基的存在[26]。当这些芳香残基暴露在不同的溶剂条件下时，荧光发射光谱的特性就会发生变化[27]。除了测量蛋白质或黄酮类物质的天然荧光外，合成荧光探针也用于研究植物蛋白-黄酮复合物的性质。最常见的例子是利用8-苯胺基萘-1-磺酸铵盐(ANS)作为疏水探针测量蛋白质的表面疏水性。Dai等[18]利用ANS荧光探针测量结合位点并监测蛋白质上暴露的非极性表面基团，结果表明：在不存在和存在原花青素的情况下，可以通过大米谷蛋白的相对结合荧光强度检测表面疏水性；大米谷物蛋白的表面疏水性随着原花青素浓度的增加而逐渐降低。

2.3 圆二色谱

由于黄酮的附着改变了蛋白质分子的三维结构，因此可以利用圆二色谱来显示蛋白质构象的变化[28]。圆二色性(CD)是由左右圆偏振光的吸附差异引起的。圆二色谱分析可以提供远紫外区域(190～250 nm)二级结构变化的相关信息，以及近紫外区域(250～390 nm)三级结构的相关信息[29]。黄酮类物质与蛋白质相互作用会影响蛋白质的二级结构。由于黄酮类物质的附着，蛋白质中α-螺旋和β-折叠比例发生定量变化。现已发现蛋白质有两种圆二色谱图，蛋白质肽键在185～245 nm处产生特征吸收峰，而主链结构在245～320 nm附近产生特征吸收峰。根据肽键特征吸收峰的峰值可计算蛋白质二级结构含量，进而分析黄酮类物质对蛋白质构型和构象的影响。Chen等[30]利用圆二色谱对大豆分离蛋白、矢车菊素—3—O—葡糖苷的保护作用进行了研究，结果反映了二者相互作用时的构象变化，伴随着β-折叠和β-翻转的增加，大豆分离蛋白的α-螺旋减少，该构象的变化可能会提高矢车菊素—3—O—葡糖苷的稳定性。

2.4 差示扫描量热

差示扫描量热法(DSC)是一种热力学技术[31]，用于研究生物大分子的热诱导转变，如蛋白质折叠和未折叠状态之间的转变。差示扫描量热仪记录到的曲线称为DSC曲线，它以黄酮与蛋白质相互作用时的吸热反应(如氢键的破坏)速率或放热反应(如疏水相互作用的破坏)速率为纵坐标，以温度或时间为横坐标，可以测定黄酮与蛋白质的相互作用引起的分子内和分子间相互作用以及所有存在组分的动力学变化。Parolia等[32]使用差示扫描量热仪测定小扁豆蛋白(LPI)与黄酮共轭物的热变性，样品的DSC曲线显示在100～115 ℃有一个放热转变峰。黄酮结合后蛋白质变性温度的峰值增加，表明接合和透析期间使用的碱性条件不会改变LPI的热稳定性和分子构象。

2.5 分子对接

分子对接是指通过计算机软件，建立小分子配体及蛋白质的分子结构，模拟二者结合的分子行为及结构变化。该方法是一种探索分子间相互作用模式的新技术，可用于研究不同类型的纳米颗粒与蛋白质的结合[33]。通过分子对接可以更形象地理解黄酮与蛋白之间相互作用的结合位点、最佳能量水平及作用力类型[34]。Fu等[35]利用分子对接技术模拟了氰基—3—O—葡萄糖苷(C3G)和蛋白质之间的相互作用。C3G和蛋白质的3 D结构，以及它们之间的结合相互作用过程如图3所示，C3G分子插入活性结合位点与氨基酸残基相互作用。通过分子对接模拟结合各种光谱的分析结果可以证实氢键和范德华力是蛋白质与C3G结合作用的主要驱动力。Xu等[36]对β-乳球蛋白与茶黄素的相互作用进行了分子模拟研究，根据氨基酸残基的类型和最低结合能的结合性质可以预测二者之间的相互作用可能通过疏水力或静电力发生。分子模拟研究表明，茶黄素的结合位点直接掩盖了免疫球蛋白E线性表位或表位附近，阻止了免疫球蛋白E接近β-乳球蛋白，为降低β-乳球蛋白的过敏性提供了一种可行的方法。

图3 氰基—3—O—葡萄糖苷与蛋白质相互作用的分子模拟研究示意图[35]Fig.3 Schematic diagram of molecular modeling study of interaction between cyanidin—3—O—glucoside and protein[35]

2.6 核磁共振

核磁共振技术具有快速、准确、完整等优点，主要用于确定蛋白质分子的结构，也可以获得所研究蛋白质的聚集状态、蛋白质动力学以及稳定性等信息[37]。随着核磁共振技术的不断推广，其在黄酮与蛋白质相互作用中的应用引起了科学界的广泛关注。利用核磁共振技术分析蛋白-黄酮复合物，可以提供准确的结构信息，如结合位点、生物活性构象和结合模式等，进而深层次探索蛋白质与黄酮相互作用的分子机制[38]。Rashidinejad等[39]利用核磁共振技术对芦丁和酪蛋白的共沉淀复合物进行了分析，结果表明，芦丁晶体的结晶度发生了显著变化，酪蛋白提高了芦丁粉末在水介质中的分散性。芦丁与酪蛋白的相互作用产生了含有高浓度芦丁的高度分散粉末，该研究提高了芦丁作为营养补充剂的生物利用度。

3 植物蛋白-黄酮相互作用对食品成分功能特性的影响

3.1 对抗氧化活性的影响

黄酮中的羟基会与蛋白质中的羟基、酰胺基和羧基相互作用[40]，导致植物蛋白-黄酮复合物结构具有特殊性，因此显示出很强的清除自由基和抗氧化能力，如槲皮素，产生抗氧化作用的能力与B环上邻苯二酚基团和C环中4位羰基共轭的2,3-双键，以及3位和5位的羟基直接相关。Nascimento等[41]证实了类黄酮与蛋白质中存在的氨基酸残基结合，二者之间发生可逆相互作用，并证明了形成的可溶性复合物的抗氧化活性显著提高。Ren等[42]研究了大豆分离蛋白和黑大豆种皮提取物复合物的性质，结果表明黄酮类物质有助于抑制大豆分离蛋白聚集，形成的复合物显示出比蛋白质具有更强的自由基清除能力。

3.2 对溶解性的影响

溶解性是蛋白质在许多食品和饮料中应用的先决条件，并可以影响其他功能，如乳化和起泡性能。Chen等[43]通过大豆蛋白与茶多酚的相互作用证实了黄酮类化合物具有增加蛋白质溶解度的能力。黄酮与蛋白质的交联会改变蛋白质分子的净电荷，进而影响蛋白质的溶解度。同时，二者的相互作用，也会改变蛋白质的氨基酸组成和氨基酸序列[44]，这些都是影响蛋白质的溶解度的重要因素。以富含蛋白质的蔬菜汁为模型，加入富含黄酮的基质后，蛋白质的溶解度和物理稳定性会发生剧烈的改变[45]。Wang等[46]通过pH值偏移法评估了大豆蛋白与疏水性姜黄素的相互作用。结果表明，大豆蛋白与姜黄素的结合是由疏水作用驱动的自发反应，大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒表现出较优的溶解性和热稳定性，二者的结合改善了姜黄素水溶性差、化学性质不稳定等缺点，提高了姜黄素在食品系统中的利用率。

3.3 对乳化特性的影响

黄酮与蛋白的相互作用通常会降低蛋白质的界面吸附速率和重组的能力，使蛋白质二级结构中无规则卷曲结构的含量和表面疏水性下降[47]，这些结构上的变化都会影响其乳化性能。黄酮与蛋白质交联，提高了蛋白质分子油水界面的吸附结合能力，增加了蛋白质的乳化功能。但在一些情况下，过量的黄酮会破坏蛋白质结构的柔韧性，使蛋白乳化性能变差[48]。

Dai等[49]以豌豆蛋白和葡萄籽24-原花青素(GSP)为原料制备了胶体复合物，与豌豆蛋白单体相比，豌豆蛋白-GSP复合物略微降低了乳液的等电点、热稳定性和盐稳定性，但提高了它们的乳化稳定性。Jauregi等[50]证实了白藜芦醇与蛋白质颗粒形成纳米复合物，提高了其溶解度和抗氧化活性，纳米乳液中油滴表面吸附的蛋白质的亲水性增强，在形成纳米乳液时油滴稳定存在水相中，不易聚集成大颗粒，进而使纳米乳液的乳化稳定性增强。该成果有望用于含有生物活性成分的食品或饮料的改良配方。

3.4 对其他功能特性的影响

在食品加工中，植物蛋白-黄酮相互作用会影响食品的感官特性。在面包的加工过程中，通常利用富含黄酮类的物质强化其感官特性以及增强其健康益处。黄酮类物质与小麦蛋白质相互作用可以延迟淀粉的糊化和老化，从而进一步影响面团硬度、吸水率和口感。植物蛋白与黄酮的相互作用也会对食品的营养学特性产生影响[51]。Kadam等[52]的研究表明，植物蛋白与姜黄素的络合作用可以促使姜黄素的水溶性显著提高，并通过体外连续模拟胃和肠道消化试验表明姜黄素的生物利用度在络合后提高近28%。功能属性表明植物蛋白-黄酮复合物具有良好的泡沫形成能力和乳液稳定性，可以被配制成一种功能性食品，并在食品配方中作为一种优良的亲脂性生物活性分子载体。蛋白质-黄酮类复合物也被设计用于延缓食品中生物活性成分的降解，有效地保护疏水性营养物质不被降解。Yi等[53]发现与豌豆蛋白(PPI)稳定的乳液相比，姜黄素的加入显著增加了β-胡萝卜素的保留率，达70%以上。姜黄素在界面上的存在可以有效清除紫外光诱导的自由基，保护β-胡萝卜素不被降解。

4 总结与展望

综上所述，植物蛋白质和黄酮类化合物作为食品基质中两种重要的组成成分，它们的相互作用和相关变化在食品加工中具有重要意义。二者通过共价或非共价相互作用交联，使反应物的化学结构发生变化，并对蛋白质的抗氧化性、溶解性和乳化性造成影响，从而形成具有独特的物理和化学特性的植物蛋白-黄酮复合物。此外，这些相互作用会影响食品的感官特性和营养学特性，也可用于延缓食品中有效生物活性成分的降解。尽管关于植物蛋白-黄酮复合物的制备及在食品加工中的应用已有大量的学者进行多方面研究，证实了这种相互作用的确切机制有助于改善食品加工条件和营养潜力，但植物蛋白-黄酮复合物对食品的功能性、食品的营养价值和食品的生物利用率造成多大程度的影响，仍然存在疑问。因此，为进一步明确食品加工及贮藏过程中植物蛋白-黄酮的结合特性，更好地改善植物蛋白-黄酮的生物活性和生物利用率，还需要对不同加工条件下二者的相互作用进行更深入的研究。