李恩民，曹瑞伟，陈 龙，章潮军，徐慧婷

（1.浙江昌海制药有限公司，浙江 绍兴 312000；2.绍兴文理学院 脂溶性维生素浙江省工程研究中心，浙江 绍兴 312000）

半胱氨酸（Cys）又称为L-半胱氨酸（L-Cys），是一种含硫氨基酸，存在三种构型（L型、D型和DL型），仅有L型在体内具有活性。半胱氨酸因其特有的理化性质[1]和反应活性[2]，广泛应用于食品、饲料、化妆品及医药领域[3]。半胱氨酸在医药领域，肝功能恢复依赖于其盐酸盐；还可应用于放射性药物中毒、锑中毒的治疗以及肝炎和血清病等[4-5]。Cys是一种含硫氨基酸，可组成蛋白质，起着营养和免疫的功效。帕金森、老年痴呆、嗜睡、水肿等疾病的发生与人体中半胱氨酸含量的上下大幅度波动相关，因此实时准确地检测体内半胱氨酸的含量至关重要。

1980年，从膀胱结石中以胱氨酸形式发现了半胱氨酸，迄今为止，针对制剂中其含量的检测方法也是层出不穷，如化学容量法、光谱法、高效液相色谱法等[6-10]。本文采用荧光分光光度法测定制剂中半胱氨酸的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与主要试剂

F-4500荧光分光光度计，日本岛津株式会社；电子天平，梅特勒-托利多。

罗丹明B、碘、碘化钾、盐酸、半胱氨酸，均为市售，分析纯；实验用水为蒸馏水。

1.2 实验步骤

1.2.1 溶液的配制

（1）罗丹明B标准溶液的配制

取一250 mL容量瓶，精确称量0.119 8 g罗丹明B固体，适量蒸馏水溶解，定容，可得罗丹明B贮备液（5.0×10-3mol/L），使用时稀释10倍。

（2）碘标准溶液的配制

加入15 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液溶解准确称量的1.265 0 g碘固体，振动30 s，密封静置以确保碘完全溶解（无色），而后使用分析天平准确称取3.6 g碘化钾固体，加入15 mL 1.0 mol/L的盐酸溶液，冷沸水于100 mL容量瓶中定容，最后将溶液转入棕色细口瓶中，静置36 h待用，即0.05 mol/L碘的贮备液，使用时需稀释10倍。

（3）L-半胱氨酸供试品的配制

取一100 mL容量瓶，精确称量1.210 1 g L-半胱氨酸固体，适量1.0 mol/L的盐酸溶液溶解，蒸馏水定容，得0.01 mol/L的L-半胱氨酸供试品，使用时需稀释100倍。

1.2.2 标准曲线的绘制

室温下，于50 mL容量瓶中分别加入精确提取的0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL Cys对照液，加2.00 mL 1.0×10-3mol/L碘标准溶液，摇匀，反应5 min，再依次加入3.00 mL 1.0×10-4mol/L罗丹明B溶液、5.00 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，蒸馏水定容，静置10 min，578 nm下测定荧光强度。

分别对0.80μmol/L、1.00μmol/L、2.00μmol/L半胱氨酸对照液进行精密度实验，见图1。

图1 标准曲线的绘制

由实验数据计算得，Y=224.1c+323.73（R2=0.991 5），在0.00～2.00μmol·L-1浓度区间时两者呈线性关系。本实验平行进行11次空白溶液的测定，计算出标准偏差S，根据公式计算出检测限为3.14×10-9mol·L-1。

分别对0.80μmol/L、1.00μmol/L、2.00μmol/L进行精密度实验得RSD为0.8%、1.7%、1.6%（n=5）。

1.2.3 半胱氨酸样品测定

取一粒半胱氨酸胶囊，除胶囊壳，取出其中粉末称量后加10 mL 0.1 mol/L盐酸搅拌溶解，与不溶物一起转移到1 L量瓶中，蒸馏水定容，过滤，得半胱氨酸胶囊供试品溶液。于50 mL容量瓶中精确量取0.5 mL的半胱氨酸胶囊供试品溶液，加入2.00 mL 1.0×10-3mol/L碘标准溶液，摇匀，于室温下反应5 min，依次加入3.00 mL 1.0×10-4mol/L罗丹明B溶液、5.00 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，蒸馏水定容，静置10 min后，测定荧光强度。带入标准曲线计算半胱氨酸的浓度。按照实验方法平行测定5次。

精密量取新配制的半胱氨酸样品溶液1.00 mL于比色管中，于其中加入1.00 mL半胱氨酸对照品溶液，蒸馏水定容至10 mL，得样品溶液，即加样回收实验。

精密度测量结果如表1所示。

表1 精密度实验

加样回收结果如表2所示，可得加样回收率为90.33%。

表2 加样回收实验

2 结论

本文对制剂中半胱氨酸含量的测定选用的是荧光猝灭的原理，检出限为3.14×10-9mol·L-1，明显优于高效液相色谱法（0.01 mg·mL-1）。

按照实验方法绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=224.1c+323.73（R2=0.991 5），当半胱氨酸 浓 度 于0.00～2.00μmol·L-1区间时，两者呈线性关系。对0.80 μmol·L-1、1.00μmol·L-1、2.00μmol·L-1进行精密度实验得RSD为0.8%、1.7%、1.6%（n=5）。

按照实验方法测定制剂中半胱氨酸的含量，计算得半胱氨酸含量为标示量的106.77%，RSD约为1.28%，回收率为90.33%。

该方法不需催化、加热等复杂过程便可完成制剂中半胱氨酸含量的快速测定，具有操作简单，稳定性好，灵敏度高，精确度、准确度良好等优点。