苏圆， 雍海月， 王勤

(江苏省肿瘤医院 药学部， 江苏 南京 210009； 江苏省肿瘤防治研究所 药学部， 江苏 南京 210009； 南京医科大学附属肿瘤医院 药学部， 江苏 南京 210009)

小儿呼吸道细菌感染(infantile respiratory infection，IRI)是临床上常见的一种感染性疾病，感染可直接或继发于病毒感染之后，病原菌调查显示常见的细菌有肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌等[1]。小儿呼吸系统发育不完全，免疫系统不完善，感染后较难自愈，且病情反复迁延，影响儿童的生长发育[2]。近5年治疗小儿呼吸道感染临床数据分析发现，阿莫西林(amoxicillin，Amo)联合清热型中成药如小儿豉翘清热颗粒、小儿清肺化痰颗粒等，治疗小儿呼吸道感染效果优于单药治疗，目前的联用机制研究多从炎症通路的角度阐释[3]，但免疫学角度的分析尚处于实验现象解释阶段。中药三萜类成分诸如灵芝三萜、熊果酸及雷公藤三萜等具有明确的干预体内巨噬细胞极化的作用，此类性质与抗炎、抗肿瘤等活性有密切的关联[4]，然而其介导的巨噬细胞极化作用协同Amo治疗呼吸道感染的可行性及潜在机制研究尚不多见。因此，本研究拟以巨噬细胞极化作用为切入点，通过幼鼠开喉滴入克雷伯菌混悬液法构建呼吸道感染模型，以病理切片、炎症因子、各类免疫细胞数量及巨噬细胞特征标志物为考察指标，评价灵芝三萜、熊果酸两类中药三萜成分单独或与阿莫西林联合使用治疗幼鼠呼吸道感染的可行性，以及2种中药成分介导的不同巨噬细胞极化过程对Amo治疗幼鼠呼吸道感染作用的影响和潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物和菌株来源 40～50 d的Sprague Dawley(SD)幼鼠42只，雌雄各半，体质量130～150 g，由扬州大学比较医学中心提供[实验动物许可证号SCXK(苏)2017-0007]；动物于室温(23±2)℃，相对湿度为60%～80%的环境中适应性喂养7 d后实验；肺炎克雷伯菌购自中科院微生物所，实验前配制成终浓度为1.5×109CFU备用。

1.1.2主要药物和试剂 Amo(先声药业)；灵芝酸B(纯度>98%)和熊果酸(纯度>99%，南京阿仙奴)，水合氯醛(使用时配制成10%溶液，北京北化精细化学)，白细胞介素-2(interleukin 2, IL-2)、IL-6、IL-10及IL-1β酶联免疫吸附试验盒(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA；上海源叶生物)，鼠抗别藻青蛋白耦联的CD206(allophycocyanin-conjugated CD206, APC-CD206)和藻红蛋白耦联的CD86(phycoerythrin-conjugated CD86, PE-CD86)单克隆抗体(美国Biolegend)，多色T细胞标志物组合[异硫氰基荧光素标记的CD3(fluorescein isothiocyanate-conjugated CD3，FITC-CD3)、藻红蛋白耦联的CD4(phycoerythrin-conjugated CD4，PE-CD4)、别藻青蛋白耦联的CD8(allophycocyanin-conjugated CD8, CD8-APC)抗体及异硫氰基别藻青蛋白耦联的CD19B(isothiocyanate allophycocyanin-conjugated CD19B, IAPC-CD19B)细胞标志物抗体(美国Abcam)]，其余化学试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器 酶标仪(Thermo MK3)和CELL-DYNl600全自动血液分析仪(雅培)，DG3090洗板机(南京华东电子)，X-15R离心机(美国BECKMAN ALLEGRA )，XW-80A漩涡混合器(江苏海门麒麟)，移液器(美国Eppendorf)，DHG9030A电热恒温箱(上海般诺生物)，CytoFLEX流式细胞仪(英国BECKMAN COULTER)。

1.2 研究方法

1.2.1造模[5]和分组 42只SD幼鼠随机均分为正常(Normal)组、模型(Model)组、Amo组、熊果酸(ursolic acid，UA)组、灵芝酸B(ganoderic acid B，GA-B)组、Amo+UA组及Amo+GA-B组，Normal组幼鼠不作任何灌注手术处理，其余6组幼鼠按下述方式灌注造模：10%水合氯醛4 mL/kg腹腔内注射麻醉，仰卧固定于手术板，使手术板(幼鼠头部)与水平面保持约30 °，开口器撑开幼鼠口腔暴露咽喉部，用一接注射器的钝圆针头经口插入气管，滴入含1×107CFU对数生长期的肺炎克雷伯菌混悬液0.2 mL，手术板垂直竖起并保持1 min，保证气管内菌悬液由于重力作用流入幼鼠的支气管和肺泡内；以后续肺组织病理切片、炎症因子和血常规等结果验证造模是否成功。各组灌胃给药方案为：Amo组 1 mg/kg，UA组和GA-B组为5、3 mg/kg，1次/d，连续给药7 d；Amo+UA组和Amo+GA-B组幼鼠均为同时给药、剂量同给单药组；Normal组和Model组幼鼠为同体积的生理盐水灌胃处理。治疗期间各组幼鼠自由饮水及进食。给药前和给药7 d结束时，麻醉状态下取各组幼鼠眼眶血分别用于后续的血常规、炎症因子及免疫细胞测定；取眼眶血后断颈处死各组幼鼠取肺脏后续实验使用。

1.2.2苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin，HE)[6]观察幼鼠肺组织学特征 取“1.2.1”项下各组幼鼠部分肺组织，制备石蜡块，切成厚度10 μm组织切片，梯度乙醇溶液脱蜡后，HE染色，光学显微镜下(100×)观察组织病变情况。

1.2.3血常规分析 取“1.2.1”项下给药前和给药7 d结束时各组幼鼠眼眶血0.8 mL肝素抗凝，采用全自动血液分析仪检测白细胞(white blood cells，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、红细胞(red blood cells，RBC)及超敏反应蛋白(C-reactive protein，CPR)。

1.2.4炎症因子测定 取“1.2.1”项下给药7 d结束时各组幼鼠眼眶血0.8 mL，置于EP管静止30 min，3 000 r/min离心10 min，检测血清IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平。

1.2.5巨噬细胞提取和表型测定[7]采用肺泡灌洗法提取幼鼠肺组织周围的巨噬细胞。对部分肺行支气管肺泡灌洗，支气管插管灌入无菌生理盐水，8 mL/次、5次；收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)于EP管中，3 000 r/min离心10 min，上清液-80 ℃保存待检，沉淀用RPMI-1640培养液悬浮，计数细胞，调整细胞浓度为1×109个/L，置6孔细胞培养板中，于37 ℃、5%CO2中培养3 h；待细胞贴壁后，用RPMI-1640培养液冲洗3次，弃非贴壁细胞，含0.5%EDTA胰酶消化下贴壁细胞，3 000 r/min离心10 min，制备得到高纯度的肺泡巨噬细胞；取1×105个肺泡巨噬细胞，4%多聚甲醛0.1 mL室温固定15 min，3 000 r/min离心2 min；取细胞沉淀，0.1%Triton X-100 PBS溶液和1%BSA PBS溶液分别通透和封闭30 min，APC-CD206 抗体和PE-CD86 抗体4 ℃孵育过夜，流式细胞仪检测相应通道的荧光强度；CD206和CD86 阳性细胞分别代表M2型和M1型巨噬细胞。

1.2.6T淋巴(T lymphocyte，T)和B淋巴(B lymphocyte，B)细胞分型测定[8-9]取“1.2.1”项下各组幼鼠眼眶血0.5 mL，置于含肝素钠的试管，3 000 r/min离心10 min，制备得到血细胞样本；室温用裂解缓冲液(含NH4Cl 41.45 g、NaHCO35 g及0.5 mmol/L EDTA 1 mL)5 mL溶解RBC 20 min；PBS 1 mL洗涤2次，所制得的细胞分别用多色T细胞标志物组合抗体10 μL和APC-CD19 B细胞标志物5 μL抗体染色，避光反应20 min，3%流式标准(flow cytometry standard，FCS)细胞分选缓冲液洗涤2次，悬浮后用流式细胞仪检测相应荧光通道的细胞比例；其中，CD3+代表总T细胞，CD4+代表T辅助细胞，CD8+代表T效应细胞，CD19+代表B细胞。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肺组织学特征

Normal组幼鼠肺组织结构清晰，无明显炎症细胞浸润及充血现象；Model组幼鼠肺组织以小支气管为中心呈灶状分布，支气管壁多处充血，管腔内大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞为主，肺泡腔变圆，轻度扩张；Amo组幼鼠肺组织支气管壁充血明显减轻，但管腔内仍见少量炎症细胞浸润；GA-B组幼鼠肺组织支气管壁充血有不同程度的减轻，但炎症细胞浸润程度高于Amo组；UA组和Amo+UA组幼鼠肺组织支气管壁仍见充血；Amo+GA-B组幼鼠肺组织支气管腔形态基本正常，未见明显的炎症细胞浸润或充血现象。

图1 各组幼鼠治疗7 d时肺组织学特征(HE，×100)Fig.1 The lung pathological section of rat pups after 7 days of treatment (HE，×100)

2.2 血常规

血常规主要指标比较结果表明，与同组治疗前比较，Amo组、GA-B组、Amo+GA-B组幼鼠治疗后WBC数量和CPR水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与治疗前Normal组相比，Model组、Amo组、GA-B组、UA组、Amo+GA-B组、Amo+UA组幼鼠治疗前WBC数量和CPR水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与治疗后Normal组相比，Model组、UA组、Amo+UA组幼鼠治疗后WBC数量和CPR水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与治疗后Model组相比，Amo组、GA-B组、Amo+GA-B组幼鼠治疗后WBC数量和CPR水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与治疗后Amo组相比，UA组、Amo+UA组幼鼠治疗后WBC数量和CPR水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；各治疗组幼鼠治疗前、后RBC与HGB水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组幼鼠治疗前、后的血常规主要指标Tab.1 Blood test of rat pups before and after treatment

2.3 血清炎症因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平

结果表明，与Normal组相比，Model组、Amo组、GA-B组、UA组及Amo+UA组幼鼠血清炎症因子IL-2水平升高，Model组和UA组幼鼠血清炎症因子IL-6水平升高，Model组、Amo组、GA-B组及UA组幼鼠血清炎症因子IL-10和IL-1β水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比，除UA组IL-2外(P>0.05)，各组幼鼠血清炎症因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β等水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Amo组相比，Amo+GA-B组幼鼠血清炎症因子IL-2、IL-10及IL-1β水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组幼鼠治疗后血清炎症因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平Tab.2 Level of serum IL-2,IL-6,IL-10, and IL-1β of rat pups after

2.4 巨噬细胞表型

结果表明，与Normal组比较，Model组、Amo组、UA组及Amo+UA组幼鼠BALF中PE-CD86荧光值升高、APC-CD206荧光值降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较， GA-B组及Amo+GA-B组幼鼠BALF中PE-CD86荧光值降低、APC-CD206荧光值升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A、B分别为各组PE-CD86和APC-CD206的荧光信号；(1)与Normal组比较，P<0.05；(2)与Model组比较，P<0.05。图2 各组幼鼠治疗后BALF中PE-CD86和APC-CD206荧光值Fig.2 Fluorescence values of PE-CD86 and APC-CD206 of BALF in each group of rat pups after treatment

2.5 血清CD3+、CD4+及CD8+水平

结果表明，与治疗前相比，GA-B组、UA组、Amo+GA-B组和Amo+UA组幼鼠治疗后 血清CD3+、CD4+及CD8+水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Normal组、Model组及Amo组比较，GA-B组、UA组、Amo+GA-B组和Amo+UA组幼鼠治疗后血清CD3+、CD4+及CD8+水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组幼鼠治疗前、后血清CD3+、CD4+及CD8+的水平Tab.3 The level of CD3+,CD4+, and CD8+ in the plasma of rat pups before and after

2.6 血清B细胞水平

结果表明，同组幼鼠治疗前、后血清CD19+(B细胞)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗前各组幼鼠血清CD19+(B细胞)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后各组幼鼠血清CD19+(B细胞)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组幼鼠前、后血清CD19+水平Tab.4 The level of CD19+ in the plasma of rat pups before and after

3 讨论

小儿上呼吸道感染是临床小儿常见病症，其发病反复，治疗周期长，目前临床上首选药物为Amo颗粒，但临床疗效不甚理想[10-11]。Amo是一种临床上常用的半合成青霉素类抗生素，对大多数致病的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有强大的抑菌和杀菌作用，其机制是穿过细菌的细胞壁，内酰胺键随即水解并与胞内转肽酶共价连接，使细菌的细胞壁合成途径受阻，细菌因渗透压失衡无法存活[11-12]。这种以直接干预细菌生理活性为基础的抗菌药物，一般对机体的免疫功能无直接影响[10，12]。众所周知，免疫系统对于细菌的侵入、炎症的产生和恢复具有及其重要的影响[11]。巨噬细胞是免疫系统中一种重要的免疫细胞，在机体损伤初期，M1型巨噬细胞会大量募集于病灶部位，激活一系列复杂的炎症通路；在机体损伤恢复阶段，M2型巨噬细胞则会抑制炎症的发生发展，参与组织修复[13-15]。因此，本研究提出假想：提高M2型巨噬细胞的水平有助于Amo治疗小儿上呼吸道感染。

为验证这一假想，本研究选用2种不同的三萜类中药成分GA-B和UA作为免疫干预组分。前期研究表明，这2种成分可分别提高M2型和M1型巨噬细胞的比例[4]。本研究首先在动物水平上建立幼鼠呼吸道炎症模型，经过3种单独治疗和2种联合给药方案治疗后，观察幼鼠肺部HE染色的病理切片；结合病理组织切片结果分析，Model组幼鼠肺组织小支气管呈灶状分布、气管壁充血，管腔内见炎症细胞浸润、肺泡腔变圆、有扩张，表明该方法可以成功造模[10]；Amo组幼鼠给药后支气管壁充血有明显好转，管腔仅见少量炎症细胞浸润；GA-B组幼鼠支气管壁充血现象稍有减轻，但炎症细胞浸润高于Amo组；UA组幼鼠治疗效果不如GA-B组。3种单独治疗组中Amo和GA-B可以一定程度上改善幼鼠肺部组织细菌感染症状，UA与模型组相比未见明显改善；Amo+GA-B组幼鼠肺组织支气管腔形态与Normal组类似，提示Amo和GA-B具有潜在的联用增效效应；Amo+UA组幼鼠肺部组织仍有明显炎症感染区域，提示该组合无上述联合增效效应。

血常规结果提示，模型组幼鼠WBC和CPR水平高于Normal组，提示模型建立成功；治疗后Amo和GA-B组幼鼠WBC数量与Model组相比均有降低，但是UA组幼鼠WBC未见明显下降；相应各组幼鼠CPR也表现出的明显降低，这些结果和趋势与病理切片结果趋势相一致。

巨噬细胞极化过程对Amo治疗幼鼠肺部细菌感染方面有重要影响，降低M1极化，提高M2细胞表型比例可能促进抗生素的抗菌消炎疗效发挥[16-17]。炎症因子表达升高是细菌性呼吸道感染的重要标志[18]。炎症因子ELISA结果表明，Model组幼鼠血清炎症因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β等水平升高，进一步提示模型构建成功；Amo组和GA-B组幼鼠4种血清炎症因子水平均有下降，从炎症因子角度提示2组单独治疗可以缓解幼鼠炎症程度；UA组幼鼠血清炎症因子仅在IL-6和IL-10上有差异；当Amo与GA-B联用后，幼鼠血清IL-2、IL-10及IL-1β水平较Amo组降低，提示该联用方案有联合治疗的潜力；但是Amo与UA联用后的各炎症指标与Amo单独治疗组相比无变化，提示该联用方案无联合增效效应；定量分析来看，Amo+GA-B组幼鼠较Amo组在IL-2、IL-10及IL-1β上分别降低43.7%、27.1%及32.2%；巨噬细胞极化结果表明，经过GA-B治疗后，幼鼠BALF中的M2型巨噬细胞荧光信号相比Model组大幅提升，但M1型巨噬细胞比例显著降低；而使用另一种中药三萜UA治疗后，M2型巨噬荧光信号相比Model组明显降低，但M1表型升高明显。相同的趋势在各自联合治疗组中也被观察到。结合前部分药效学和血常规等结果分析，提示肺泡中的M2型巨噬细胞提升、M1型巨噬细胞降低，可能有助于协助Amo进行抗呼吸道感染的治疗[19]。

通过组合T细胞抗体标记法，本研究定量分析了治疗前、后T细胞总量、T辅助细胞和T效应细胞。T细胞是体内一类协助体液免疫和细胞免疫的重要免疫细胞[20-22]，根据其表面标志物分为CD3+/CD4+的T辅助细胞和CD3+/CD8+的T效应细胞[23]；T辅助细胞可以增殖扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞，通过调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能[24]；T效应细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因其可对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭[25]。因此，2种细胞比例的升高是体内免疫功能提高的重要体现，也是杀伤致病菌，减轻炎症的免疫保障。对于T细胞作用的评价，Amo组与Model组相比，无论是总T细胞数量，还是T辅助细胞、T效应细胞数量均未发生改变。联合治疗组总T细胞的比例升高趋势类似于三萜类单独治疗组，提示2种三萜类成分在提升T细胞数量和各亚型T细胞数量方面无差异。B细胞来源于骨髓造血干细胞，在体内受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能，与T细胞一样属于体内重要的免疫细胞[26]。但是，本研究发现各治疗组均不能提高血液中B细胞的比例。

综上所述，GA-B与UA对巨噬细胞、T细胞和B细胞等主要免疫细胞的作用差异主要体现在对巨噬细胞极化作用的干预上；Amo+GA-B与Amo+UA两种联合治疗的疗效差异与三萜类化合物对巨噬细胞表型干预密切有关。本研究从巨噬细胞极化的角度出发，结果表明M2型巨噬细胞含量的提高有助于Amo治疗幼鼠细菌性呼吸道感染，从而为诱导M2型巨噬细胞的免疫干预成分与抗生素联合治疗呼吸道感染提供更多可参考的用药依据。