杨博凯，王志会，张玉蕾，武 鑫，刘金龙*

(1.山西农业大学基础部 化学生态研究所，山西 太谷030801；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷030801)

核桃青皮一般占果实质量的50%以上，其含有大量醌类、黄酮类及多酚等生物活性物质，因此开发核桃青皮的潜在价值，实现核桃青皮的高值利用，对于提高核桃产业经济效益具有重要意义[1]。植物多酚主要分布在植物根、果壳和果肉中[2]，在结构上植物多酚可大致分为2类：水解单宁和缩合单宁，在性质上植物多酚的多羟基结构与蛋白质、多糖等物质以氢键缔合成各种各样的结合多酚。植物多酚作为植物体内重要的次生代谢产物，直接或间接参与了许多代谢反应,是影响植物生长发育的主要因素之一，同时对人体也极为有益。研究表明，植物多酚具有抗氧化作用[3-4]，能够预防高血糖、高血脂和心脑血管等疾病[5-6]，而且还能降低癌症风险[7]。植物多酚具有收敛性，用其制成的护肤品可使皮肤的毛孔收缩，让皮肤细腻[8]。此外，利用植物多酚对紫外波段的吸收特性，可以减少因日晒引起皮肤黑色素的形成。核桃青皮多酚是绿色天然的化合物，其含量仅次于蒽醌和黄酮类[9]，在农业、食品及医药等领域具有很高的利用价值。因此，核桃青皮多酚的研究和开发越来越成为关注的热点。

近年来，植物多酚的提取方法主要有溶剂提取法、生物酶解法、大孔树脂吸附法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、亚临界或超临界流体萃取法、高压脉冲电场萃取法以及闪蒸提取法等[10-11]。尽管一些新型的提取分离技术可用于核桃青皮多酚的提取，例如微波辅助提取法和超声波辅助提取法，其应用尚处于实验室阶段，受工艺条件和成本的限制，不适合规模化生产。经典的溶剂提取法虽然在提取效率上有一定局限性，但由于提取条件简单、易于量化生产，仍占据主导地位。针对溶剂提取法中提取溶剂的极性问题，结合核桃青皮多酚的理化特性，可掺入功能助剂以改进溶剂提取法[12]。六偏磷酸钠(sodium hexametaphosphate,SHMP)为偏磷酸钠聚合体的一种，具有胶体性质，在水中溶解度大，但溶解速度较慢，且不恒定，不溶于有机溶剂[13]。张海燕等[14]用SHMP溶液从甜菜干粕中提取果胶时，发现SHMP可与果胶中的Ca2+形成螯合物，有利于果胶的溶出；赵国建等[15]利用SHMP辅助溶剂法成功提取了茄子多酚。作者从量化生产需求角度出发，考虑到各种提取方法的优缺点，采用SHMP辅助溶剂法提取核桃青皮多酚，通过单因素实验和响应面法优化核桃青皮多酚的提取工艺，为核桃青皮的深度研发提供理论基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

核桃，采自山西省太原市郊。收集剥离的核桃青皮，洗净后置于烘箱中60 ℃杀青，烘干至恒重，常温下粉碎，过80目筛，密封、干燥、避光的条件下保存，备用。

没食子酸标准品，成都思科华生物技术有限公司；硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、无水乙醇、六偏磷酸钠(SHMP)等试剂均为市售分析纯。酒石酸亚铁溶液(分别称取0.500 g硫酸亚铁和2.500 g酒石酸钾钠溶于蒸馏水中，定容至500 mL)；pH值7.5的磷酸缓冲溶液(分别称取3.736 g磷酸氢二钠和0.734 g磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，定容至500 mL)。

棱光721N型可见分光光度计；电子分析天平；HH-42型数显恒温三用水箱；80-2型电动离心机；ZD-88型恒温摇床。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮多酚的SHMP辅助提取

准确称取干燥的核桃青皮粉末 2.00 g 于150 mL具塞锥形瓶中，加入一定体积分数的乙醇、适量SHMP，以保鲜膜封口，充分摇匀后，置于恒温摇床进行浸提；将提取液减压抽滤，离心，取上清液测定核桃青皮多酚含量。

1.2.2 核桃青皮多酚含量的测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

以没食子酸标准品为参照物，采用酒石酸亚铁比色法测定核桃青皮多酚含量。精确称取没食子酸标准品1.701 2 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得0.10 mol·L-1标准储备液；准确稀释100倍后，得1.0×10-3mol·L-1标准溶液。分别移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL的1.0×10-3mol·L-1标准溶液于25 mL容量瓶中，加入4 mL蒸馏水、5 mL酒石酸亚铁溶液，用pH值7.5的磷酸缓冲溶液定容，摇匀，得没食子酸浓度(mol·L-1)分别为0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4的标准溶液。以1 cm比色皿，于 540 nm 波长处测定吸光度。以没食子酸浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程：A=3.0×103c-0.0044，R2=0.9996。

1.2.2.2 多酚提取率的测定

准确移取5.0 mL提取液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2.1方法测定540 nm处吸光度，按下式计算核桃青皮多酚提取率(mg·g-1)：

式中：c为多酚浓度，mol·L-1；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数，此处取5.0；M为没食子酸的相对分子质量；m为核桃青皮干粉的质量，g。

1.2.3 SHMP辅助提取工艺优化

在45 ℃水浴条件下进行单因素实验，分别考察乙醇体积分数、液料比、提取时间、SHMP用量等4个因素对核桃青皮多酚提取率的影响。 在单因素实验的基础上，利用Design-Expert 软件设计4因素3水平响应面实验，选取乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)、SHMP用量(D)为自变量，以核桃青皮多酚提取率为响应值，所有实验均重复3次，结果取平均值。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

1.3 数据统计与分析

计算重复实验的平均值(m)和标准偏差(sd)，结果以m±sd的形式表示，分别采用Design-Expert、SPSS、Origin等软件进行实验设计和数据处理，以P<0.05的Duncan新复极差法进行数据的显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对核桃青皮多酚提取率的影响

固定液料比为20∶1(mL∶g,下同)、提取时间为80 min、SHMP用量为0.1%，考察乙醇体积分数(20%、30%、40%、50%、60%)对核桃青皮多酚提取率的影响，结果如图1所示。

图1 乙醇体积分数对核桃青皮多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趋势，当乙醇体积分数为50%时，多酚提取率达到最高(5.95 mg·g-1)，显著高于其它处理组。这是由于，乙醇通过羟基与多酚物质以氢键缔合，破坏多酚与蛋白质、多糖等大分子之间的结合，使得多酚溶解于提取液中[16]；但乙醇体积分数过大时，提取液的极性将会相应减小，提取液与核桃青皮中多酚物质极性的相似程度变差，依照相似相溶原则，使得多酚物质在提取液中的溶解度减小。因此，选择乙醇体积分数为50%作为响应面实验的中心水平。

2.1.2 液料比对核桃青皮多酚提取率的影响

固定乙醇体积分数为50%、提取时间为80 min、SHMP用量为0.1%，考察液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1) 对核桃青皮多酚提取率的影响，结果如图2所示。

图2 液料比对核桃青皮多酚提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由图2可知，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趋势，当液料比为25∶1时，多酚提取率达到最高(6.33 mg·g-1)，显著高于其它处理组。这是由于，提取溶剂用量的增加使得多酚溶解量的增幅加大，对多酚提取率的升高起到明显的促进作用；但液料比过大时，受原料中多酚物质总量的限制，多酚物质溶解量的增幅减小，对多酚提取率的升高不能起到明显的促进作用。因此，结合提取效率及溶剂消耗情况，选择液料比为25∶1作为响应面实验的中心水平。

2.1.3 提取时间对核桃青皮多酚提取率的影响

固定乙醇体积分数为50%、液料比为20∶1、SHMP用量为0.1%，考察提取时间(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min) 对核桃青皮多酚提取率的影响，结果如图3所示。

由图3可知，随着提取时间的延长，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趋势，当提取时间为100 min时，多酚提取率达到最高(7.19 mg·g-1)。这是由于，随着提取时间的延长，核桃青皮中多酚物质与大分子之间的结合被充分断开，有利于提取；但提取时间过长，提取液中的多酚物质因为长时间与空气接触会被氧化成醌，反而导致多酚提取率降低。因此，选择提取时间为100 min作为响应面实验的中心水平。

图3 提取时间对核桃青皮多酚提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

2.1.4 SHMP用量对核桃青皮多酚提取率的影响

固定乙醇体积分数为50%、液料比为20∶1、提取时间为100 min，考察SHMP用量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对核桃青皮多酚提取率的影响，结果如图4所示。

图4 SHMP用量对核桃青皮多酚提取率的影响Fig.4 Effect of SHMP dosage on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由图4可知，SHMP的加入对于核桃青皮中多酚物质的提取有明显的促进作用，且随着SHMP用量的增加，核桃青皮多酚提取率明显升高，当SHMP用量增至0.4%时，多酚提取率达到最高(7.78 mg·g-1)；继续增加SHMP用量，多酚提取率降低。这是由于，SHMP呈碱性，可以使多酚物质离子化，有利于提取；但SHMP过多，使得自由溶剂分子减少反而导致提取液活性降低，多酚溶解度也随之减小[17]。因此，选择SHMP用量为0.4%作为响应面实验的中心水平。

2.2 响应面实验结果(表2)

表2 响应面实验设计与结果Tab.2 Design and results of response surface methodologies

运用Design-Expert 软件对表2数据进行多元回归拟合，得到回归模型方程为：Y=8.04+0.20A+0.29B+0.089C+0.083D-0.15AB-0.13AC+0.032AD+0.019BC+0.015BD-0.073CD-0.40A2-0.30B2-0.42C2-0.53D2。

对上述回归模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

2.3 响应面分析

各因素交互作用对核桃青皮多酚提取率影响的响应面图和等高线图如图5所示。

在三维响应面图中，响应值从小到大的变化越快则响应面的坡度越陡峭，说明此因素对多酚提取率的影响越显著，反之，响应面越平缓，说明此因素对多酚提取率的影响越小。在等高线图中，最小圆的中心为响应值的最大值，圆形表示2个因素之间的交互作用较弱，椭圆形表示2个因素之间的交互作用较强。由图5a、b、f可知，响应面曲面较陡峭，等高线为椭圆形，表明乙醇体积分数与液料比、乙醇体积分数与提取时间、提取时间与SHMP用量之间的交互作用较强，对多酚提取率的影响显著；由图5c、d、e可知，响应面曲面较平缓，等高线接近于圆形，表明乙醇体积分数与SHMP用量、液料比与提取时间、液料比与SHMP用量之间的交互作用较弱，对多酚提取率的影响较小。

图5 各因素交互作用对核桃青皮多酚提取率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot for interaction between various factors on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

2.4 最佳提取工艺的确定及验证

利用响应面法对回归模型进行分析，得到核桃青皮多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数50%、液料比25∶1、提取时间110 min、SHMP用量0.4%，多酚提取率的预测值为8.12 mg·g-1。在此工艺条件下，进行3次验证实验，测得核桃青皮多酚平均提取率为8.14 mg·g-1，可见验证实验的结果与模型预测值比较接近，此模型较真实地拟合了实际情况[18]，具有一定的实践指导意义。

3 结论

通过单因素实验考察了乙醇体积分数、液料比、提取时间、SHMP用量对核桃青皮多酚提取率的影响，在单因素实验的基础上，通过响应面法进行了4因素3水平优化实验。结果表明，各因素对核桃青皮多酚提取率的影响顺序为：液料比>乙醇体积分数>提取时间>SHMP用量；最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取时间110 min、SHMP用量0.4%，在此条件下，核桃青皮多酚提取率为8.14 mg·g-1，虽不及微波辅助提取法的核桃青皮单宁提取率(20.36 mg·g-1)[9]，但与超声波辅助提取法的核桃青皮多酚提取率(10.49 mg·g-1)[19]接近，说明添加适量SHMP，可提高溶剂提取法的多酚提取率，此法可用于量化生产。