◎ 林子豪，彭名军，周庆琼，曾豪威，戚 平

（广州市食品检验所，广东 广州 511400）

近年来，野生蘑菇中毒事件屡见不鲜，中毒类型包括急性肝损害型、神经精神型、光过敏皮炎型、胃肠炎型等[1]。其中急性肝损害型占因蘑菇中毒死亡事件总数的70.49%，主要由鹅膏肽类毒素引起。鹅膏肽类毒素包括鹅膏毒肽和鬼笔毒肽，其化学性质稳定，一般的烹调加工不会破坏其毒性[2]。常见的鹅膏毒肽有α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和γ-鹅膏毒肽，其半数致死量分别为0.3 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1。鹅膏毒肽进入人体后被肝细胞快速吸收，中毒患者先后经历潜伏期、胃肠炎期、假愈期和内脏损害期4个阶段，若不及早治疗会导致死亡[3]。鬼笔毒肽常伴随鹅膏毒肽出现，但不被人体吸收。常见的鬼笔毒肽包括羧基三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽。鹅膏毒肽和鬼笔毒肽均为环肽类毒素，其中鹅膏毒肽是双环八肽，鬼笔毒肽为双环七肽，同种类毒肽的差异在于取代基的区别[4]。

目前，测定鹅膏肽类毒素主要有化学显色法[5]、酶联免疫法[6]、分光光度法[7]、高效液相色谱法[8]和液相色谱串联质谱法[9-11]。虽然液相色谱串联质谱法是目前热门的分析方法，但大多数研究采用分辨率较低的四极杆串联质谱进行分析，其质量精度仅能达到整数级别，在测定时容易受到复杂基质的干扰。四极杆飞行时间质谱相比四极杆串联质谱具有更高的分辨率，区别于串联四极杆的多反应监测模式，四极杆飞行时间质谱采用全质谱信息扫描模式，能够同时获得高精确度的母离子及碎片离子信息，根据需要选择母离子或碎片离子精确质荷比进行定量，同时能结合二级质谱精确质量数推断碎片结构和质谱断裂机理。本研究拟通过优化色谱质谱条件，结合高稀释比技术[12]，建立野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）快速分析方法，为鹅膏肽类毒素的快速鉴定和相关中毒事件应急处置提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Waters Xevo G2-XS超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，配电喷雾离子源（美国Waters公司）；Allegra X-30R离心机（美国Beckman Coulter公司）；M37610-33CN涡旋混匀器（德国IKA公司）；MS204TS/02电子天平（0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）。

α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽（纯度≥90%，美国Cayman Chemical公司）；羧基三羟鬼笔毒肽：10 μg·mL-1，福州勤鹏生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；乙酸、甲酸（LC/MS级，美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽标准溶液（0.1 mg·mL-1）：准确称取1 mg标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL，-20 ℃保存。

1.2.2 样品前处理

将样品粉碎后，准确称取试样0.20 g（精确至0.01 g）置于15 mL聚丙烯刻度离心管中，加入5 mL甲醇-水（V/V=50/50），涡旋振荡5 min，在10 000 r·min-1下离心5 min，上清液转移至另一离心管中，重复提取一次，合并提取液。移取0.25 mL上清液，加入0.75 mL水，涡旋混匀并过0.22 μm滤膜后，上机测定。

1.2.3 液相色谱-串联质谱条件

（1）液相条件。柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL·min-1；色 谱 柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为水，流动相B为0.1%乙酸-乙腈。洗脱梯度：0～1.5 min，3% B；1.5～3.0 min，3%→35% B；3～5 min，35%→50% B；5～6 min，50%→80% B；6.0～6.1 min，80%→3% B；6.1～8.0 min，3% B。

（2）质谱条件。采用电喷雾离子源正离子模式（ESI+），毛细管电压3.0 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，锥孔气流速50 L·h-1，脱溶剂气流速800 L·h-1，采集模式为MSe模式，分辨率大于20 000；质量范围为50～1 200 Da；Lock Spray双喷雾离子源：亮氨酸脑啡肽溶液，ESI+为556.277 1 Da。6种鹅膏肽类毒素的质谱信息见表1。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本研究比较了乙腈和水、0.1%甲酸-乙腈和水、0.1%乙酸-乙腈和水等3种流动相的分离效果和信号响应。以乙腈和水为流动相时，母离子主要表现为[M+Na]+峰，[M+H]+峰响应较差。以0.1%甲酸-乙腈和水为流动相时，α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽不能实现基线分离，α-鹅膏毒肽的13C同位素峰（相对丰度为43%）将会对β-鹅膏毒肽的测定造成干扰。改用酸性较弱的0.1%乙酸-乙腈和水进行色谱分离，[M+H]+峰响应相比以乙腈和水为流动相有了较大提升，α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽也基本实现基线分离，6种鹅膏肽类毒素的色谱图如图1所示。因此本研究采用0.1%乙酸-乙腈和水作为流动相。

表1 6种鹅膏肽类毒素的质谱信息表

图1 6种鹅膏肽类毒素的色谱图

2.2 二级质谱特征碎片

6种鹅膏肽类毒素的特征碎片见表1。α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和γ-鹅膏毒肽均属于鹅膏毒肽，具有相同的母核，α-鹅膏毒肽与β-鹅膏毒肽仅在R1位有一个-NH2和-OH的差异，γ-鹅膏毒肽仅比α-鹅膏毒肽在R2位少一个-OH。通过精确质量数拟合分析，推测α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽的二级特征碎片m/z259为羟脯氨酸和二羟基异亮氨酸组成的二肽，γ-鹅膏毒肽的二级特征碎片m/z243则是羟脯氨酸和一羟基异亮氨酸组成的二肽，另一组特征碎片m/z86来自羟脯氨酸脱羧后的碎片离子。羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽均属于鬼笔毒肽，也具有相同的母核，通过精确质量数拟合分析，推测羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽的二级特征碎片m/z330为色氨酸和二羟基亮氨酸组成的二肽，羧基三羟鬼笔毒肽的二级特征碎片m/z346则是色氨酸和三羟基亮氨酸组成的二肽，另一组特征碎片m/z157来自色氨酸脱羧后的碎片离子。

2.3 基质效应的考察

样品的基质效应ME=100%×（样品基质中目标物峰面积）/（纯溶剂中目标物峰面积），与样品的稀释倍数相关。当基质效应控制在80%～120%时，可以认为基质效应较弱，基本不影响样品定量。由于在中毒事件应急处置过程中不宜采用较为复杂的前处理方式，因此本研究在满足方法灵敏度的前提下，通过增大样品稀释倍数以消除基质效应的干扰。考察了野生蘑菇样品在不同稀释倍数下的基质效应，发现当稀释倍数为200时基本无基质效应，结果如图2所示。

2.4 方法学验证

6种鹅膏肽类毒素的保留时间、线性方程、相关系数和回收率见表2。结果表明，6种鹅膏肽类毒素在5～100 ng·mL-1呈现良好的线性关系，线性相关系数均大于0.995，检出限为0.4 mg·kg-1，定量限为1 mg·kg-1。以空白野生蘑菇为样品，在0.1～8.0 mg·kg-1的水平下进行加标回收实验，平均回收率为74.1%～119.9%，相对标准偏差为0.1%～6.7%（n=6）。

2.5 实际样品的测定

按照本研究建立的方法，对广州周边采集到的10个野生蘑菇样品进行检测，在其中2个样品中检出部分鹅膏肽类毒素，具体结果见表3。

图2 6种鹅膏肽类毒素基质效应图

表2 6种鹅膏肽类毒素的保留时间、线性方程、相关系数和回收率表

表3 阳性野生蘑菇样品的检测结果表（单位：mg·kg-1）

3 结论

本研究通过优化仪器条件和样品的稀释倍数，建立了基于溶剂标准校正的6种鹅膏肽类毒素的UPLCQ-TOF MS快速分析方法。对采集到的10个野生蘑菇样品进行检测，在其中2个样品中检出了鹅膏肽类毒素。本方法快速准确，适合于野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素的快速检测。