李矜 张晨 辛竞妍 吴长江 朱雨菲 张涛静

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者中常见的慢性并发症之一，该病在糖尿病患者中的发病率超过60%[1]，目前有研究表明，DPN的发病与氧化应激及炎症反应等有关。DPN目前的西医治疗多采用控制血糖联合营养神经及减轻炎症反应等方法。有研究表明，单用西医治疗疗效劣于中西医同治，尤其中药复方制剂能作用于DPN发病机制的多个靶点[2]，成为近期研究热点。在对糖尿病周围神经病变的临床治疗及实验研究中，中药复方糖络宁制剂的疗效已经得到初步证实[3-6]，本课题组前期研究表明，糖络宁制剂能通过调控微小RNA表达有效改善高糖环境中大鼠背根神经节神经元细胞(dorsol root ganglion neurons,DRGn)细胞的氧化应激及细胞凋亡。本实验则是在体外研究的基础上探索糖络宁含药血清对高糖环境下miR-146a的调控及其对高糖诱导下的大鼠背根神经节细胞炎症反应的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级6～8周龄雄性SD大鼠20只及临产期雌性SD大鼠若干只，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。本实验期间饲养于北京中医药大学动物实验中心，饲养标准：大鼠SPF级屏障环境，中心温度(20±2)℃，湿度45%～65%，12小时明暗交替照明。本实验流程由北京中医药大学东方医院伦理委员会论证通过。

1.2 实验药物

糖络宁复方制剂(主要成分为生黄芪20 g、山茱萸9 g、川续断12 g、狗脊15 g、丹参15 g、全蝎6 g、木瓜10 g)，生药浓度为0.5 g/mL，本制剂制于北京中医药大学东方医院制剂室。

1.3 主要试剂

miR-146a激动剂(miR-146a mimics)由广州锐博生物公司合成；CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒(011521210435)购自碧云天; DMEM(dulbecco’s modified eagle medium )(C11995500BT)、Neurobasal(神经基础)培养基(21103049)购自Gibco; SuperScript III RT 逆转录试剂盒 (ABI-invitrogen ，批号：WC3125084); Sybr qpcr mix (ABI-invitrogen，批号：WC1315116); BeyoRTTMII cDNA 第一链合成试剂盒 (碧云天，批号：011521211537)。

1.4 正常血清及含药血清的制备

20只大鼠随机均分为2组，每组10只，分为含药血清组及正常血清组，根据以往实验得出的最佳用药浓度分别以糖络宁生药浓度按5 g/(kg·d)及蒸馏水等体积灌胃，连续给药10天。每天早晚灌胃，期间保持其余饲养条件相同及稳定。最后一次灌胃后的两小时内腹腔注射 2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉成功后去除腹毛，酒精消毒，用无菌眼科剪暴露腹主动脉，用一次性采血针及真空采血管分别收集两组大鼠腹主动脉血液，在37℃的环境中静置2小时，3500 rpm离心，取上层血清于60摄氏度水浴灭活30分钟，过滤器过滤除菌，除菌后的含药血清放置于-80℃的环境中保存备用。

1.5 大鼠背根神经节细胞的分离及分组培养

参考本实验组以往的动物研究[7-9]进行DRGn细胞的分离，将24小时内的新生大鼠于75%的乙醇中消毒后置于培养皿中，无菌眼科剪剪开大鼠背部皮肤并将椎管沿纵向剪开，暴露脊髓后分离其两侧的DRG组织并去除包膜，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)溶液冲洗DRG组织2次后将DRG组织剪碎，用0.25%的胰蛋白酶完全消化并用尖头吸管吹打形成单细胞悬液。12000 rpm条件下离心5分钟，待细胞沉淀后加入DMEM完全培养基，重悬细胞，并将细胞接种于培养板，培养6小时后弃去DMEM完全培养基，PBS溶液清洗后将细胞置于神经元专用培养基中，并加入阿糖胞苷纯化，按3.5日一次的频率换液，直至70%～80%的细胞贴壁后按照实验需求进行分组。本实验以既往研究结果设定150 mmol/L为高糖浓度，并将细胞分为正常组、高糖组、糖络宁组及miR-146a基因过表达组，其中正常组(空白血清培养)、高糖组(150 mmol/L葡萄糖+空白血清培养)、糖络宁组(150 mmol/L葡萄糖+糖络宁含药血清培养)、miR-146a基因过表达组(150 mmol/L葡萄糖+miR-146a激动剂)，48小时后，收集各组细胞并进行相关检测。

1.6 CCK-8 方法检测各组细胞活力。

将DRGn细胞接种至96孔板中，同时设置5个复孔，按上述分组培养24小时后加入10微升CCK-8溶液，于37℃烘箱避光孵育1小时，酶标仪比色，检测波长为450纳米处的光密度(optical density，OD)值并计算细胞活力(实验组OD值/正常组OD值×100%)，同样方法依次检测培养48小时及72小时的细胞活力值。

1.7 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组细胞上清液中炎症因子的表达情况

将各组细胞收集，离心(3000 rpm，10分钟)，吸取上清液备用，按照ELISA试剂盒操作步骤依次检验炎症因子[白介素-6、白介素-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)-α]的表达情况。每组实验独立重复3次。

1.8 实时荧光定量 PCR检测各组细胞miR-146a和各炎症因子的表达水平

取各组神经元细胞，并提取各组背根神经元总核糖核酸。紫外分光光度计分别检测RNA的浓度及纯度。按操作说明反转录合成cDNA，依次加入操作说明提示的试剂，42℃孵育50分钟，85℃孵育5分钟，得到的cDNA -20℃环境下保存。再以合成的cDNA进行扩增，反应结束后记录CT值，运用2-ΔΔCt公式计算相对数值，实验独立重复三次，计算平均值。引物序列见下表1。

表1 引物序列

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 糖络宁含药血清对细胞活力的影响

各组细胞OD值随作用时间的延长而逐渐下降。在相同时间点，与正常组相比，高糖组、糖络宁组及miR-146a基因过表达组OD值均明显下降(P<0.05)。与高糖组相比，糖络宁组与miR-146a基因过表达组细胞OD值均明显升高(P<0.05)。说明DRGn细胞在高糖环境下活力下降，而经糖络宁及miR-146a激动剂干预后，细胞活力可明显上升。见表1。

表1 不同时间点各组细胞OD值的比较

2.2 糖络宁含药血清对细胞上清液中炎症因子蛋白表达的影响

与正常组相比，高糖组、糖络宁组及miR-146a基因过表达组的炎症因子蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与高糖组相比，糖络宁组与miR-146a基因过表达组的炎症因子蛋白表达水平均明显下降(P<0.05)。说明高糖条件下，炎症因子蛋白表达水平上调，而糖络宁及miR-146a激动剂可明显抑制炎症因子的蛋白表达。见表2。

表2 各组细胞上清液中炎症因子的蛋白相对表达水平比较

表3 各组细胞炎症因子的基因相对表达水平比较

2.3 糖络宁含药血清对细胞炎症因子基因表达的影响

与正常组相比，高糖组、糖络宁组及miR-146a基因过表达组的炎症因子基因表达水平均明显升高(P<0.05)。与高糖组相比，糖络宁组与miR-146a基因过表达组的炎症因子基因表达水平均明显下降(P<0.05)。说明高糖条件下，炎症因子基因表达水平上调，而糖络宁及miR-146a激动剂可明显抑制炎症因子的基因表达水平。

2.4 糖络宁含药血清对细胞miR-146a基因表达的影响

与正常组相比，高糖组、糖络宁组的miR-146a基因表达水平均明显下降(P<0.05)，miR-146a基因过表达组miR-146a基因表达水平明显升高(P<0.05)，与高糖组相比，糖络宁组与miR-146a基因过表达组的miR-146a基因表达水平均明显升高(P<0.05)，与糖络宁组相比，miR-146a基因过表达组的miR-146a基因表达水平均明显升高(P<0.05)。说明DRGn细胞在高糖条件下，miR-146a基因表达水平下调，而糖络宁可明显上调miR-146a的基因表达水平。

表4 各组细胞中miR-146a基因的相对表达水平比较

3 讨论

DPN在中医学中尚未有明确的病名，结合目前的临床及实验研究，现代各医家对DPN的病因病机等有着不同的见解，多认为该病可属于中医“消渴痹病”“脉痹”“痿证”等范畴[10]，其辨证为气血不足、经脉受阻、气滞血瘀。糖络宁则是针对其气血不足、肝肾亏虚、脉络瘀阻所研制[11]，目前研究发现糖尿病周围神经病变的发生发展是多种因素共同作用的结果，其作用机制十分复杂，主要与炎症作用、糖代谢产物的过度堆积、多元醇通路的激活、氧化应激、神经营养因子缺乏及RNA的非编码调节作用等多种因素有关[12]。miR-146是最先发现在免疫应答中发挥正反馈调节作用的miRNA，包含miR-146a和miR-146b两个成员[13]。炎症反应是当机体感受到内、外界某些有害刺激时产生的一种防御性反应[14]。其中TNF-α是一种炎症前因子，不仅可引起组织炎性损伤，还可刺激白介素-6等促炎因子形成，白介素-6作为促炎作用最强的细胞因子与肿瘤坏死因子-α共同起到促炎作用[15]。由于DPN的发生发展始终伴随着炎症反应，周围神经受损后，轴突出现变性，白介素-6、白介素-1β、TNF-α等细胞因子表达上调，启动炎性级联反应，激活核转录因子，诱导细胞凋亡[16]。

目前有研究表明，中药提取物或中药复方制均可有效减轻糖尿病周围神经病变的炎症反应，如穿山龙提取物薯蓣皂苷能抑制PDPN大鼠血清中白介素-6、VCAM-1的表达，有效缓解PDPN大鼠体内的炎症反应[17]。中药复方制剂加味黄芪桂枝五物汤对DPN的治疗机制可能是通过上调miR-146a，进而抑制白介素-1β、TNF-α激活，从而减少炎症因子的表达，减轻炎症反应[18]。本课题组前期针对糖络宁对DPN的治疗机制做出的研究表明糖络宁复方制剂能有效通过调控miR-200a、miR-211及其相关通路影响氧化应激及细胞凋亡，本实验同时证明糖络宁可通过调控miR-146a减轻炎症反应，证明糖络宁可作用于多靶点实现对DPN的治疗，但本实验目前仅建立在体外细胞实验的基础上，还需在日后完善该药物在体内的研究。

综上所述，糖络宁可明显上调miR-146a的基因表达水平，同时抑制白介素-6、白介素-1β、TNF-α的表达，由此可以推测糖络宁能够减轻高糖诱导的背根神经节细胞炎症反应，其部分机制可能是通过上调miR-146a的表达水平实现的。