李玉磊 刘莉敏 熊 静 （武汉科技大学附属天佑医院呼吸与危重症医学科，武汉 430064）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是重症患者经常发生的一种急性肺损伤，以肺部广泛炎症反应和氧气吸入减少为特征，常导致呼吸衰竭和多器官功能障碍，病死率高达60%，目前仍缺乏有效降低ARDS病死率的方法［1］。ARDS进展中，严重炎症反应会诱导肺上皮细胞凋亡、坏死和纤维化，加速肺损伤［2］。因此，如何有效抑制肺上皮细胞炎症反应和凋亡对开发有效的ARDS治疗策略意义重大。长链非编码RNA（lnc-RNA）和微小RNA（miRNA）是非编码RNA的重要成员，前期研究表明lncRNA和miRNA参与细胞增殖、代谢调控、组织分化等多种过程，其表达失调可能导致一系列功能障碍和疾病［3-4］。长基因间非编码RNA 00707（LINC00707）位于10p14区，其作用已在成骨分化、结直肠癌、肝癌等疾病中得到了证实［5-7］。此外，有报道称LINC00707通过靶向miR-30a-5p缓解脂多糖（LPS）诱导的PC12细胞炎症和凋亡，是脊髓损伤的潜在治疗靶点［8］。靶基因预测显示，miR-374a-3p与LINC00707存在结合位点。miR-374a-3p在骨关节炎患者软骨组织和LPS诱导的软骨细胞中表达降低，上调其表达可减轻LPS诱导的软骨细胞损伤［9］。但LINC00707在ARDS中的作用及其是否靶向miR-374a-3p调控ARDS进展尚不清楚。本研究采用LPS刺激肺上皮细胞体外模拟ARDS炎症发病机制［10］，探讨LINC00707靶向miR-374a-3p对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡和炎症因子释放的影响，为LINC00707/miR-374a-3p轴在ARDS中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常肺上皮细胞BEAS-2B购自武汉普诺赛生命科技公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；LINC00707的小干扰RNA（si-LINC00707）、miR-374a-3p mimics、miR-374a-3p抑制剂（anti-miR-374a-3p）、LINC00707过表达质粒（pcDNA-LINC00707）及各自阴性对照（si-NC、miRNC、anti-miR-NC、pcDNA）购自上海生工生物公司；第一链cDNA合成试剂盒购自广州吉赛生物科技公司；miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自广州复能基因公司；SYBR green master mix试剂盒购自南京诺维赞生物公司；IL-6、IL-1β ELISA试剂盒及Annexin V-FITC-PI凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司；兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-caspase3）多克隆抗体（ab49822）、兔源cleaved-caspase9多克隆抗体（ab2324）、山羊抗兔IgG（ab205718）、兔源GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基37 ℃、5%CO2培养BEAS-2B细胞，细胞融合达到80%时按1∶4传代。取2×105个对数期BEAS-2B细胞接种至6孔板，利用Lipofectamine2000将序列片段或质粒分别转染至40%融合的BEAS-2B细胞，收集转染48 h的BEAS-2B细胞进行后续实验。采用10 µg/ml LPS处理BEAS-2B细胞48 h构建细胞损伤模型，记为LPS组。正常培养的BEAS-2B细胞记为对照组；转染pcDNA、pcDNALINC00707、si-NC、si-LINC00707的BEAS-2B细胞分别记为pcDNA组、pcDNA-LINC00707组、si-NC组、si-LINC00707组。10 µg/ml LPS处理转染si-NC、si-LINC00707、miR-NC、miR-374a-3p mimics、si-LINC-00707+anti-miR-NC、转 染 si-LINC00707+anti-miR-374a-3p的BEAS-2B细胞48 h，依次记为LPS+si-NC组、LPS+si-LINC00707组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-374a-3p组、LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC组、LPS+si-LINC00707+anti-miR-374a-3p组。

1.2.2 RT-qPCR检测LINC00707和miR-374a-3p表达 采用Trizol试剂分离Con组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-LINC00707组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-374a-3p组、LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC组、LPS+si-LINC00707+anti-miR-374a-3p组细胞总RNA，微量分光光度计测量不同RNA样本纯度和浓度。采用第一链cDNA合成试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录，SYBR green master mix试剂盒进行RT-qPCR反应检测LINC00707和miR-374a-3p 表达。2-ΔΔCt分析 LINC00707 和 miR-374a-3p表达。LINC00707 F：5′-TCACATCTGTGAAAAGAGTGCT-3′；LINC00707 R：5′-TGCACCAAGAAAGTTGAGGGT-3′；GAPDH F：5′-GGAGCCAAAAGGGTCATC-3′；GAPDH R：5′-CCAGTGAGTTTCCCGTTC-3′；miR-374a-3p F：5′-CUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUU-3′；miR-374a-3p R：5′-AAUUACAAUACAAUCUGAUAAG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6 R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 ELISA试剂盒检测IL-6和IL-1β释放量BEAS-2B细胞按1.2.1分组处理完毕后，收集上清，参照ELISA试剂盒说明书分析细胞上清中IL-6和IL-1β水平，表示IL-6、IL-1β释放量。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 采用预冷的PBS洗涤各组BEAS-2B细胞2次，重悬于1×结合缓冲液（1×106个/ml），将 5 µl Annexin V-FITC、5 µl PI分别添加到100 µl细胞悬液中，避光孵育20 min，补加1×结合缓冲液使总体积达到500 µl混匀，流式细胞仪检测各组BEAS-2B细胞凋亡率。

1.2.5 Wesrern blot检测cleaved-caspase3和cleavedcaspase9蛋白表达 预冷PBS洗涤各组BEAS-2B细胞2次，加入RIPA缓冲液冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清，BCA试剂盒进行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转至硝酸纤维素膜，室温下用含5%脱脂乳Tris-吐温20-缓冲盐水（TBST）封闭膜2 h，4 ℃添加cleavedcaspase3（1∶500 稀释）、cleaved-caspase9（1∶1 000 稀释）、GAPDH（1∶2 500稀释）一抗孵育过夜，TBST洗涤3次，室温下添加山羊抗兔二抗IgG抗体（1∶2 000稀释）孵育30 min，TBST洗涤3次，化学发光法检测蛋白条带，Image J软件分析目的蛋白和GAPDH条带灰度值表示目的蛋白表达。

1.2.6 双荧光素酶报告实验 starbase数据库预测LINC00707和miR-374a-3p的结合位点，将包含miR-374a-3p结合位点的LINC00707野生（wt）序列及不含结合位点的LINC00707突变（mut）序列分别克隆至pmirGLO基本载体，构建wt-LINC00707、mut-LINC00707荧光素酶报告质粒，将miR-374a-3p mimics、miR-NC分别与wt-LINC00707或mut-LINC-00707共转染BEAS-2B细胞，48 h后裂解各组细胞，以海肾荧光素酶荧光强度为内参，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组BEAS-2B细胞相对荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，每组设3个平行，实验独立重复3次，结果以±s表示。采用独立样本t检验评估两组间数据差异，采用单因素方差分析和Tukey's多重比较检验分析多组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS诱导的肺上皮细胞损伤中LINC00707和miR-374a-3p表达 与Con组相比，LPS组BEAS-2B细胞LINC00707表达显著升高（P＜0.05），miR-374a-3p表达显著降低（P＜0.05，表1）。

表1 LPS诱导的肺上皮细胞损伤中LINC00707和miR-374a-3p表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LINC00707 and miR-374a-3p in LPS-induced lung epithelial cell injury （±s，n=9）

表1 LPS诱导的肺上皮细胞损伤中LINC00707和miR-374a-3p表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of LINC00707 and miR-374a-3p in LPS-induced lung epithelial cell injury （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05.

Groups Con LPS t P LINC00707 1.00±0.00 3.07±0.231）27.000 0.000 miR-374a-3p 1.00±0.00 0.38±0.041）47.250 0.000

2.2 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放的影响 与Con组比较，LPS组BEAS-2B细胞LINC00707表达显著升高（P＜0.05），IL-6和IL-1β释放量显著增加（P＜0.05）；与LPS+si-NC组比较，LPS+si-LINC00707组BEAS-2B细胞LINC00707表达显著降低（P＜0.05），IL-6和IL-1β释放量显著减少（P＜0.05，表2）。

表2 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of interfering LINC00707 expression on release of inflammatory cytokines in LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

表2 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of interfering LINC00707 expression on release of inflammatory cytokines in LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

Groups Con LPS LPS+si-NC LPS+si-LINC00707 F P 1.00±0.00 3.15±0.241）3.19±0.22 1.86±0.122）338.691 0.000 81.14±7.02 268.20±17.841）277.13±19.79 150.57±14.112）338.600 0.000 32.44±3.35 170.87±11.761）179.48±13.13 57.37±5.472）590.661 0.000 LINC00707IL-6/（pg·ml-1）IL-1β/（pg·ml-1）

2.3 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的影响 与Con组比较，LPS组BEAS-2B细胞凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与 LPS+si-NC组比较，LPS+si-LINC00707组BEAS-2B细胞凋亡率、cleavedcaspase3和cleaved-caspase9蛋白表达显著降低（P＜0.05，图1、表3）。

表3 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Influence of interference with LINC00707 expression on apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

表3 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Influence of interference with LINC00707 expression on apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

Groups Con LPS LPS+si-NC LPS+si-LINC00707 F P Apoptosis rate（%）6.15±0.57 33.91±3.021）34.49±3.11 10.96±0.842）405.228 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.24±0.02 0.66±0.051）0.68±0.05 0.31±0.032）302.238 0.000 cleaved-caspase9 protein 0.19±0.02 0.56±0.041）0.59±0.05 0.28±0.032）266.889 0.000

图1 干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of interference with LINC00707 expression on apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells

2.4 LINC00707靶向调控miR-374a-3p表达 Star-Base在线软件预测显示，miR-374a-3p与LINC00707具有特异性互补的核苷酸序列（图2）。WT-LINC-00707共转染中，与转染miR-NC比较，转染miR-374a-3p后BEAS-2B细胞相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；MUT-LINC00707共转染中，与转染miR-NC比较，转染miR-374a-3p后BEAS-2B细胞相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。pcDNA-LINC00707组BEAS-2B细胞miR-374a-3p表达比pcDNA组显著降低（P＜0.05）；si-LINC00707组BEAS-2B细胞miR-374a-3p表达比si-NC组显著升高（P＜0.05，表5）。

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Fig.2 Complementary nucleotide sequence of LINC00707 and miR-374a-3p （±s，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Fig.2 Complementary nucleotide sequence of LINC00707 and miR-374a-3p （±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-374a-3p t P WT-LINC00707 1.02±0.08 0.41±0.041）20.460 0.000 MUT-LINC00707 1.03±0.07 1.00±0.06 0.976 0.344

表5 LINC00707靶向调控miR-374a-3p表达（±s，n=9）Tab.5 LINC00707 targeted expression of miR-374a-3p（±s，n=9）

表5 LINC00707靶向调控miR-374a-3p表达（±s，n=9）Tab.5 LINC00707 targeted expression of miR-374a-3p（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05； compared with si-NC group， 2）P＜0.05.

Groups pcDNA pcDNA-LINC00707 si-NC si-LINC00707 F P miR-374a-3p 1.00±0.00 0.35±0.031）0.99±0.06 3.14±0.292）603.332 0.000

图2 LINC00707与miR-374a-3p的互补核苷酸序列Fig.2 Complementary nucleotide sequence of LINC00707 and miR-374a-3p

2.5 miR-374a-3p过表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的影响 与LPS+miR-NC组比较，LPS+miR-374a-3p组BEAS-2B细胞miR-374a-3p表达显著升高（P＜0.05），IL-6和IL-1β释放量、凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达显著降低（P＜0.05，图3、表6）。

图3 miR-374a-3p过表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of miR-374a-3p overexpression on apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells

表6 miR-374a-3p过表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Effect of miR-374a-3p overexpression on releases of inflammatory factors and apoptosis of lung epithelial cells induced by LPS （±s，n=9）

表6 miR-374a-3p过表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Effect of miR-374a-3p overexpression on releases of inflammatory factors and apoptosis of lung epithelial cells induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups LPS+miR-NC LPS+miR-374a-3p t P miR-374a-3p 1.00±0.00 2.96±0.221）26.727 0.000 IL-6/（pg·ml-1）273.14±18.29 173.54±11.121）13.959 0.000 IL-1β/（pg·ml-1）182.08±13.06 69.17±5.911）23.630 0.000 Apoptosis rate（%）35.63±3.15 13.14±1.031）20.358 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.67±0.05 0.39±0.031）14.406 0.000 cleaved-caspase9 protein 0.58±0.04 0.31±0.031）16.200 0.000

2.6 抑制miR-374a-3p表达逆转了干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的作用 与LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC组比较，LPS+si-LINC00707+anti-miR-374a-3p组BEAS-2B细胞miR-374a-3p表达显著降低（P＜0.05），IL-6和IL-1β释放量、凋亡率、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达显著升高（P＜0.05，表7、图4）。

表7 抑制miR-374a-3p表达逆转了干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-374a-3p expression reversed effect of interfering with LINC00707 expression on inflammatory factor release and apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

表7 抑制miR-374a-3p表达逆转了干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-374a-3p expression reversed effect of interfering with LINC00707 expression on inflammatory factor release and apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC LPS+si-LINC00707+anti-miR-374a-3p t P miR-374a-3p 1.00±0.00 0.36±0.041）48.000 0.000 IL-6/（pg·ml-1）146.17±11.88 224.87±18.691）10.661 0.000 IL-1β/（pg·ml-1）56.16±4.68 129.74±11.951）17.200 0.000 Apoptosis rate（%）10.02±0.93 25.24±2.181）19.265 0.000 cleaved-caspase3 protein 0.30±0.02 0.57±0.051）15.041 0.000 cleaved-caspase9 protein 0.25±0.02 0.47±0.051）12.256 0.000

图4 抑制miR-374a-3p表达逆转了干扰LINC00707表达对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的作用Fig.4 Inhibition of miR-374a-3p expression reversed effect of interfering with LINC00707 expression on apoptosis of LPS-induced lung epithelial cells

3 讨论

近年多项研究揭示了lncRNA在ARDS中的作用。YAO等［11］研究发现，ARDS患者和LPS处理的人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMEC）中lncRNA转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）表达上调，敲减MALAT1可抑制HPMEC凋亡，降低HPMEC中促炎细胞因子表达，减轻ARDS患者肺损伤。WANG等［12］研究证实，lncRNA X染色体失活特异转录物（XIST）可诱导炎症细胞浸润、肺泡炎症和纤维化，加重LPS诱导的小鼠ARDS。WANG等［13］报道TNF相关和异质核蛋白相关免疫调节lncRNA（lnc-THRIL）可预测脓毒症患者ARDS风险增加，且lnc-THRIL表达水平与疾病严重程度、炎症和死亡率呈正相关。因此，lnc-RNA在ARDS中有望成为诊断或治疗靶点，本研究在LPS诱导的BEAS-2B细胞中发现LINC00707表达上调，提示LINC00707可能参与ARDS发生发展，功能分析显示，转染si-LINC00707干扰LINC00707表达后LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症因子IL-6和IL-1β释放量降低，凋亡率下降，表明干扰LINC00707表达可抑制LPS的诱导BEAS-2B凋亡和炎症反应。此外，干扰LINC00707表达后促凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表达显著下调，进一步证实其可逆转LPS诱导的细胞凋亡。既往研究表明，LPS可抑制人胚肺成纤维细胞MRC-5活力，促进细胞凋亡和炎症反应，而干扰LINC00707表达可减轻LPS诱导的MRC-5细胞损伤，与本研究中干扰LINC00707表达的保护作用一致［14］。表明干扰LINC00707通过抑制细胞凋亡和炎症因子分泌对LPS诱导的肺上皮细胞损伤发挥保护作用。

LINC00707富含miRNA结合位点，多项研究证实LINC00707可结合miRNA负调控其表达参与多种疾病进展［15-16］。如LINC00707通过靶向下调miR-876促进乳腺癌细胞体外增殖、迁移和侵袭和体内肿瘤生长［17］。本研究证实miR-374a-3p是LINC-00707的直接靶点。据报道，miR-374a-3p在氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）作用的内皮中表达降低，过表达miR-374a-3p可抑制内皮凋亡和炎症因子释放，保护 ox-LDL 引起的内皮损伤［18］。此外，miR-374a-3p介导敲减lncRNA小核仁RNA宿主基因5（SNHG5）还可提高LPS诱导的肾小管上皮细胞活力，降低细胞凋亡率和炎症细胞因子水平，进而抑制脓毒症诱导的急性肾损伤［19］。本研究表明，LPS诱导的BEAS-2B细胞miR-374a-3p表达降低，过表达miR-374a-3p明显下调cleaved-caspase3、cleavedcaspase9蛋白表达，抑制细胞凋亡和炎症因子分泌，逆转LPS诱导的细胞凋亡和炎症反应，与过表达miR-374a-3p对LPS诱导的BEAS-2B细胞损伤保护效果类似。由于miR-374a-3p表达受LINC00707负调控，本研究推测在BEAS-2B细胞中可能存在LINC00707/miR-374a-3p途径，恢复实验表明，抑制miR-374a-3p表达明显逆转干扰LINC00707对LPS诱导的BEAS-2B细胞凋亡和炎症因子分泌的抑制作用，进一步证实LINC00707靶向负调控miR-374a-3p参与LPS诱导的肺上皮细胞损伤。

综上，本研究证实干扰LINC00707通过靶向上调miR-374a-3p可抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎症因子释放和凋亡，减轻LPS诱导的肺上皮细胞损伤，表明靶向抑制LINC00707/miR-374a-3p途径可能是一种潜在的ARDS治疗策略。