李熙颜，李江飞，陈 诗，吴俊文，蔡年辉,，许玉兰,*

(1.西南林业大学 云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224)

林木的表型性状是遗传改良与种苗繁育的重要指标，通过研究表型性状可以提高良种选育及种质复壮的效率，在林木种苗培育过程中，生长性状、生物量等指标是直接影响苗木生长的关键因素[1]，能较好反映苗木质量，其中，植物各器官生物量的高低反映了光合产物在各功能部分积累的多少[2]，表征着苗木对外界环境的适应能力，其大小可反映苗木的光合面积、根系大小和茎的大小，综合体现苗木的竞争能力，常被作为苗木评价的主要指标[3-4]。生物量分配的研究是分析植物结构功能最有效的工具，是研究植物碳分配的基础，各器官生物量会随着物种、生境和个体大小等的变化而改变[5]。

一般而言，在数据的测定过程中，选取的样本容量越大，样本的代表性就越好，得出的结果也越能代表整体，但工作量会相应增加。相反，样本量过小，结果可能不能满足要求，抽样调查既可保证一定精度，又可减少工作量。现今已有的研究表明样本量会对数据的准确性产生影响，诸如样本量会对湿地松(Pinuselliottii)的遗传力估算值[6]、白桦(Betulaplatyphylla)的多态位点百分率产生影响[7]。云南松(P.yunnanensis)为松科松属常绿乔木，分布范围较广，主要分布于我国西南地区，是西南地区的乡土树种及荒山绿化造林先锋树种，也是云南省主要森林植被树种[8-10]。有大量研究表明，植物地上与地下部分生物量大小能反映植物对土壤养分或光照的需求和竞争能力[11]，地上、地下生物量比作为描述植物形态的指标之一，在探讨苗木质量、林木生长特点、碳循环分配等问题中十分重要。而不同器官间生物量分配比例的不同不仅会影响各器官生物量的累积，还会一定程度地影响苗木形态特征，最终影响苗木的生产力[12-14]。目前人们对云南松幼苗生物量的测定主要依靠整株收获法，极其耗时、耗力且破坏性大。研究样本量对云南松幼苗生物量特征的影响，在一定程度上能够减小工作量并得到较为准确的数据。从已有的关于云南松苗木生物量的研究来看，研究多在异速生长[15]、苗木分级[16]、苗木生物量估测模型[17]等方面，在样本量对云南松苗木生物量积累、分配的研究方面鲜有论及。鉴于此，本研究通过家系样本量和单株样本量2种不同的抽样方式设计不同的样本量梯度，探明样本量对云南松苗木生物量积累、分配的影响，确定得到准确性较高的生物量所需的临界样本量，期望为云南松生物量的测定提供一定参考和策略，同时为林木相关研究提供案例。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地设置在西南林业大学苗圃，位于25°04′00″N，102°45′41″E，海拔1 945 m，属北亚热带半湿润高原季风气候，年平均气温14.5 ℃，年降水量700～1 100 mm。

1.2 材料

于2014年12月在云南省昆明市宜良县进行种子采集，选取生长正常、无明显病虫害的成年云南松植株，采集发育正常且成熟的饱满球果。将采摘的球果做好标记，分类带回实验室晾晒风干，取出球果中的种子。2015年3月将所采20个家系的云南松种子用0.5%高锰酸钾溶液浸泡0.5 h，之后用清水洗净，浸泡48 h，每隔12 h换1次水。在西南林业大学苗圃用点播的方式，以5 cm×10 cm的株行距进行播种，采用完全随机设计，每个家系播种40株，重复3次。播种后盖薄膜小拱棚，出苗整齐后，不定期对云南松进行浇水、施肥、喷药等管理。于2016年12月底生长停止后，采用整株收获法，将20个家系获得的完整植株615株用于分析，称量每株根、茎、叶各组分的鲜重，分别装入纸袋，在105 ℃的烘箱中杀青30 min后，降至80 ℃烘干至恒重，称量根、茎、叶各组分的干重，即为生物量，精确至0.001 g。

1.3 研究方法

1.3.1 样本量确定 利用编写好的计算机完全随机抽样程序对20个云南松家系的数据进行抽取，设计2种抽取方式。

1.3.1.1 家系样本量 采用不同样本量对20个云南松家系进行抽样，设置家系样本量分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20，共10个样本量梯度(F1、F2、…、F10)，重复抽样10次，F10代表全体20个云南松家系。

1.3.1.2 单株样本量 采用不同样本量对615株云南松进行抽样，设置单株样本量分别为60、120、180、240、300、360、420、480、540、600，共10个样本量梯度(S1、S2、…、S10)，重复10次。

1.3.2 数据处理 利用Excel进行数据统计，用SPSS 20.0对不同样本量的各指标进行方差分析及Duncan多重比较，计算10次重复间变异系数。

1.3.3 临界样本量确定 以生物量计算值随样本量的增加不发生显著变化时的样本容量作为临界样本量，参考文献[18]设计的方法，从不同角度计算后综合分析得出临界样本量。

1.3.3.1 方法一 计算每个梯度与相邻梯度指标差的绝对值，对所有结果取平均值，得到所有梯度指标估算值的平均绝对差值(MAD，公式中用MAD表示)：

(1)

正整数m的确定方法为：从最后2个梯度开始判断，若这2个梯度不能满足上述条件，则记m=n，即梯度n所含的家系样本量为临界样本量；若满足上述条件，则再往前推一个梯度，判断n-2和n-1是否满足该条件，不满足记m=n-1，满足则继续依次进行判断，直至不满足为止。

1.3.3.2 方法二 计算所有梯度生物量值的标准差(SD)，再确定1个正整数m，使得相邻梯度间遗传力满足条件mAV-k×SD≤Wi≤mAV+k×SD(其中，k为随机比例因子，如0.1或0.2，mAV为最后n-m+1个梯度的生物量的平均值)。正整数m的确定方法同方法一。

2 结果与分析

2.1 不同样本量对云南松幼苗生物量的影响

2.1.1 不同家系样本量对云南松幼苗生物量特征的影响 由不同家系样本量下的各生物量均值(表1)可知，不同样本量下的苗木各器官及单株生物量存在相同的变化规律由大到小为：叶生物量、茎生物量、根生物量。云南松苗木的叶鲜重、地上部分鲜重、单株鲜重及叶干重在家系样本量间差异显著(P<0.05)，其他指标在不同家系样本量间无显著差异。梯度1显著大于其他梯度。比较性状间的变异系数，能看出性状间的变异系数较相近，根鲜重、茎鲜重、根干重、茎干重的变异系数要略高于其他性状。家系样本量小于6个时，各生物量指标有波动，当样本量增加到6个家系后，根、茎、叶各指标的生物量值、变异系数都逐渐趋于平稳。然而，家系样本量小于8个时，各生物量指标的标准误较高，随家系量的增加标准误降低，在家系数量增加到10个后趋于平稳。家系量较少时，生物量值具有很大的偶然性，稳定性不高，不能有效代表该群体生物量的准确值。

表1 不同家系样本量云南松苗木生物量基本情况

2.1.2 不同单株样本量对云南松幼苗生物量积累特征的影响 由不同单株样本量下的各生物量均值(表2)可知，云南松苗木的茎鲜重、叶鲜重、地上部分鲜重、单株鲜重及茎干重、叶干重、地上部分干重、单株干重在样本量间差异显著(P<0.05)，根生物量在不同单株样本量间无显著差异。所有指标的最小值均出现在60株、最大值在180株时，大于240株后根、茎、叶生物量各梯度均值平稳，说明当单株样本量较少时，各器官的生物量积累稳定性较差，有偶然性，不具代表性；比较性状间的变异系数，能看出根鲜重、茎鲜重、根干重、茎干重的变异系数要略高于其他性状，各性状的标准误和变异系数大小则随样本容量的增加逐渐降低，样本量小于300株时，二者波动较大，当样本容量增加到300以后，标准误、变异系数逐渐减小并趋于平稳状。

表2 不同单株样本量云南松苗木生物量基本情况

2.2 样本量对云南松幼苗生物量分配的影响

2.2.1 不同家系样本量对云南松幼苗生物量分配的影响 由表3可知，不同家系样本量下云南松幼苗的鲜重和干重各器官生物量分配比例在不同家系样本量间均无显著性(P>0.05)。从不同家系样本量云南松幼苗鲜重分配的分析结果来看，根、茎和叶鲜重分配间存在差异，最大叶鲜重达59.17%，最小为58.48%；最大茎鲜重达28.15%，最小为27.42%；最大根鲜重达13.63%，最小为13.31%；地上部分鲜重最大为86.69%，最小为86.37%。

表3 家系样本量对云南松幼苗生物量分配的影响

而从不同家系样本量云南松幼苗干重分配的分析结果来看，最大叶生物量达57.16%，最小为56.35%；最大茎生物量达28.65%，最小为27.68%；最大根生物量达15.27%，最小为14.82%。各器官生物量分配由大到小均表现为：叶生物量、茎生物量、根生物量，云南松幼苗将主要生物量分配给叶。随参试家系样本量越接近总样本数量(F10=20)，其鲜重和干重分配比例的标准误越稳定。

对不同家系样本量云南松幼苗各部分器官及单株鲜重、干重的变异系数进行分析(图1、图2)，鲜重和干重的变异系数随家系量的增加而降低，都表现为家系数量小于10个时，变异系数呈快速下降趋势，当家系数量大于12个时，变异系数虽有波动，但变化趋势较为平稳。最大家系样本量(F10=20)时为总样本量，苗木鲜重和干重分配比例的标准差为0，因此变异系数也为0。

2.2.2 不同单株样本量对云南松幼苗生物量分配的影响 由表4表明，不同单株样本量下云南松幼苗的茎鲜重分配比例在不同样本容量梯度间存在显著差异(P<0.05)，其他部位的生物量分配比例在不同单株样本量间不存在显著差异(P>0.05)。其中，从不同单株样本量下云南松幼苗鲜重分配的分析结果来看，根和叶鲜重分配比例依次为13.42%～13.68%、58.66%～59.23%。样本量为180株时，茎鲜重分配比最大，达到27.88%；在60个样本容量时最小，为27.09%，且地上部分生物量占单株生物量的80%以上，茎、叶生物量虽然发生变化但并未改变地上生物量分配比。

表4 不同单株样本量对云南松幼苗生物量分配比例的影响

而从不同单株样本量云南松幼苗干重分配的分析结果来看，叶、茎和根干重分配比例依次为56.40%～56.95%、27.83%～28.52%、15.08%～15.25%，地上部分生物量占单株生物量的84%以上，各器官生物量分配由大到小均表现为：叶生物量、茎生物量、根生物量，云南松幼苗将主要生物量分配给叶。参与估算的样本量越接近总样本数量，其鲜重和干重分配比例的标准误越小，说明重复间的数据变化越小，数据更加准确。

对不同单株样本量云南松幼苗各部分器官及单株鲜重、干重的变异系数进行分析(图3、图4)，鲜重和干重都表现为样本量小于360株时，变异系数有剧烈波动且无明显规律，样本量为240时，变异系数增加，说明数据较少时，变异系数不稳定；当样本量大于360时，变异系数虽有波动，但总体变化趋势较为平稳。

2.3 临界样本量的确定

通过确定临界样本量的2种方法进行分析判定计算云南松幼苗所需的临界样本量(表5)。

通过2种方法判定的计算生物量积累所用临界样本量结果显示(表5)：方法一中鲜重分配比确定的临界样本量为14～20个家系，干重分配比确定为12～14个家系，此时各部位生物量分配比均值波动较小，标准差逐渐减小；方法二中，当k=0.2时各指标所要求的临界样本量为14～18，对于不同的家系样本量，干重分配比例确定的临界样本量较鲜重确定的要更稳定一些。结合前述生物量积累和分配在不同家系样本量中的均值及标准误，对于本测定群体而言，样本量梯度为S6=12时，积累和分配均值已平稳，标准误快速降低。方法一认为每相邻2个梯度没有大的差异时即为稳定的，对于本研究中家系样本量而言，各生物量分配比在不同家系样本量的波动都较小，临界样本量为14～20时，虽然得到的误差与变异系数小，但确定的临界样本量接近全样本量，对研究及生产意义不大。方法二中比例因子k值用于判定临界样本量要求的生物量分配值变化趋于平稳的程度，其值越小，所要求的生物量分配比例值波动越小，其是将波动幅度与标准差相比较，而标准差在12个家系后已经稳定，综上所述，在家系样本量大于12个家系时，既能保证生物量测定值稳定，标准差小，又能保证实际生产要求，本量大于此梯度后，标准误下降缓慢，精度无明显增加。

表5 2种方法计算各指标所需的临界样本量与生物量分配比趋于平稳后的平均值

对于不同单株样本容量而言，方法一确定的临界样本量为240～480株，此时各生物量分配比均值平稳，标准误逐渐降低。方法二当比例因子k=0.2时，所需的临界样本量为360～480株。2种方法确定的样本量在360株以前标准误及变异系数都有波动，在420株时已达到稳定状态，综合前文各部分生物量积累与分配的计算结果，对于本研究的云南松群体而言，要获得稳定性较高的生物量积累与分配计算值，需要测定云南松家系应该大于12个，测量的单株数大于360株。

3 结论与讨论

3.1 结论

从家系样本量和单株样本量对615株20个云南松家系的幼苗生物量进行分析，结果表明，云南松苗木生物量的分配由大到小均表现为：叶生物量、茎生物量、根生物量，根生物量分配比差异不显著，茎、叶分配比有变化但地上生物量变化不大；615株云南松幼苗的生物量积累和分配在不同样本量中有差异；分析不同家系样本量和单株样本量的标准误与变异系数随样本量的增加呈下降趋势，并结合2种确定临界样本量的方法，得出测定的云南松家系样本量应大于12个，或者测量的单株数大于360株，此时得到的结果与总样本量所得结果差异很小，具有代表性。

3.2 讨论

植物各器官生物量的相对高低反映光合产物在各功能部分积累的多少[19]，生物量在各器官中的分配是植物对环境长期适应的结果，其分配格局的差异是植物生理和形态因素共同作用的结果，会受到个体大小的影响，且不同时期具有不同的分配中心[5,20]。研究表明苗期云南松生物量的分配规律为地上部分生物量远大于地下部分，呈异速生长趋势[21]，本研究中设置不同的单株样本量或不同家系量，云南松苗木生物量的分配由大到小均表现为：叶生物量、茎生物量、根生物量，杨志玲等[22]研究的厚朴(Magnoliaofficinalis)生物量分配格局中也有类似的研究结果。X.Wangetal[23]对东北地区针阔混交林的地上和地下生物量研究结果发现，地上生物量和地下生物量分配比例分别为74.63%～86.21%和13.79%～25.37%，与本研究中茎、叶生物量虽然发生变化但并未改变地上生物量分配比，根生物量分配较其他部位相对稳定的结果相似，不同样本量中云南松根生物量分配比差异不显著，不会随着苗木样本量的变化而产生较大的变化。

研究表明，抽样方式不影响调查的准确性，抽样的样本数是影响调查准确性的主要因素[24]。样本量影响着抽样精度，如果抽取样本量少，对生物量总体估计量的代表性就差，抽样精度就低，反之样本量较大时，估计的精度高[25]。在计算结果时，样本量较小，计算结果标准误较大，数据间差异较大，存在偶然性；样本容量越大，样本的代表性会越好，但生物量的测定十分复杂，耗费的人力、物力也会越多[26]，选择合适的样本量能够减少测定的工作量，得到正确可靠的分析结果。因此，本研究从单株样本量和家系样本量2个方面来探究不同样本量对云南松生物量积累和分配的影响，并增加重复试验次数，克服试验中随机因素带来的误差，增加抽样技术的稳定性[27-28]。本研究中不同家系梯度抽取家系植株数大多大于30株，不同家系间植株数量虽有一定波动，但梯度间没有显著差异。因此当家系样本量大小达到6个家系、单株样本量在240个后，均值较稳定，但标准误、变异系数则在12个家系、360株之前出现明显波动，在样本多于此值后下降缓慢。同时也发现，当样本容量增加到12个家系、360株，不同重复间的差异变小。

单株样本量或家系样本量较低时生物量分配值会有一定波动的差异，且其标准误具有不稳定性，随样本量的增加精度和准确度会增加，所以临界样本量的确定要参考结合生物量计算值与标准误，在生物量值趋于平稳，标准误较小时确定临界样本量的大小。因此，在测量生物量时应考虑采用一定数量的样本测量，以确保精确度。这与张庆滢等[29]研究发现野生大麻(Cannabissativa)的遗传多样性水平在小样本量时随样本量的增加呈急速增加趋势，当抽样群体样本量大于25个个体时，遗传多样性水平增加趋势明显变缓，且包含了野生大麻居群90%以上的遗传变异；张帅楠等[6]通过对湿地松61个自由授粉家系测定林的研究表明，随着测量样本容量或家系数的增加，测量结果的精度与准确性均提高的结果相似。本研究中，第1种方法是每相邻2个梯度之间生物量值之差与平均差值相比较，将值开始平缓变化时的样本量定为临界样本量[18]，所以对于各梯度均值波动不大的指标中，所得的临界样本量会较小，不同指标得出的样本量会有较大差异。第2种方法是将波动幅度与标准差相比较，因子k的取值取决于对稳定性的严格程度，综合2种方法与前文的结果，对于本研究的测定群体而言，第1种方法直观明确，并且客观，要得到较准确的生物量计算值，所需测定的云南松家系样本量应大于12个，或者测量的单株数大于360株，此时得到的结果与总样本量所得结果差异很小，具有代表性。