葛业如，林芳花，邓亚利*

（1.华南农业大学 制药工程系，广东 广州 510642；2.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

骨质疏松症（osteoporosis）是一种多种因素导致的慢性疾病，病理学上表现为骨组织结构受损、骨质变薄、骨小梁数量减少、骨脆性增加，其根本原因在于成骨和破骨的平衡被打破［1］。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是成骨细胞的前体细胞，可以分化为软骨、脂肪、骨细胞和一些其他类型的细胞［2］，在骨骼发育重建过程中起重要作用。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是一种来源于淫羊藿的黄酮苷类化合物，具有健骨作用［3］。人参皂苷Rg1（rinsenoside Rg1，Rg1）是人参的主要药理活性成分，具有抗衰老，促进细胞增殖，刺激造血干细胞形成的作用［4-6］。淫羊藿苷和人参皂苷Rg1 单体在促进干细胞成骨方面的作用已得到证实［7］，并且已有研究证明淫羊藿苷配伍三七总皂苷能够促进成骨细胞增殖和钙化［8］，人参皂苷Rg1 是三七总皂苷有效成分之一，因此，淫羊藿苷与人参皂苷Rg1 联合用药在干细胞成骨方面具有一定的研究意义。

本研究从药物配伍的角度出发，通过体外诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，研究淫羊藿苷和人参皂苷Rg1及配伍对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1 研究材料

药物与试剂：淫羊藿苷化学对照品，批号：110737-200312；人参皂苷Rg1 化学对照品，批号：110703-200322，购于中国药品与生物制品检定所。DMEM-12培养基购自美国gibco；甘油磷酸钠购自北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸购自北京索莱宝科技有限公司；地塞米松购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自广州百旺生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自上海星汉生物科技有限公司；荧光定量PCR检测试剂盒购自美国genecopoeia 公司；骨成型蛋白2（bone mor‐phogenetic protein2，BMP2）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、成骨细胞特异性转录因子（osterix，OSX）、Runt相关转录因子（Run-related transcription factor2，RUNX2）等一抗购自上海艾博抗公司；二抗购自美国Jackson公司；ECL发光液购自杭州弗德生物技术有限公司。

仪器：SCIlogex 台式高速离心机（美国SCIlogex 公司产品）；荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司产品）；Merinton 微量核酸定量仪（美林恒通仪器有限公司产品）；多功能酶标仪（上海现科仪器有限公司产品）。

细胞：C57小鼠骨髓间充质干细胞，购自广州思晋生物技术有限公司，在37 ℃、5%CO2生物培养箱培养。

1.2 研究方法

1.2.1 淫羊藿苷和人参皂苷Rg1对骨髓间充质干细胞增殖的影响

淫羊藿苷和人参皂苷Rg1分别用DMSO溶解作为储备液，用培养基稀释不同浓度备用。

骨髓间充质干细胞分种于96孔培养板中培养24 h，换无血清培养基，分别加入不同浓度的单体药物使淫羊藿苷终浓度分别为0.1 、1 、10µmol／L，人参皂苷Rg1 终浓度分别为10、20、40µmol／L。分别在加药后培养24、48、72 h 后弃去原来的培养基，并用PBS 清洗2次，每孔加入100µL新鲜培养基和10µL CCK8试剂，37 ℃孵育1～4 h，于450 nm处检测吸光度（A）值。

1.2.2 最佳配伍浓度的确定

淫羊藿苷浓度分为A1（0.1µmol／L）、A2（1µmol／L）、A3（10µmol／L）3组，人参皂苷Rg1分为B1（10µmol／L）、B2（20µmol／L）、B3（40µmol／L）3 组，采用交互配比试验法，按1.2.1研究方法测定。

1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导

将小鼠骨髓间充质干细胞接种到6 孔培养板中，根据CCK-8检测结果设置空白对照组、经典成骨对照组、淫羊藿苷组、人参皂苷Rg1 组、配伍组。细胞融合度达到70%时更换成骨诱导培养基。每3 天更换1 次培养基，分别在成骨诱导16、30 d后进行指标检测。

1.2.4 钙化结节分析

分别在成骨诱导16、30 d后，弃去6孔培养板中的细胞培养液，用PBS洗涤2次，1.5%茜素红染色20 min，去除染色液，用蒸馏水洗涤1~2次终止显色反应，于显微镜下观察钙结节情况。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析

在成骨诱导16、30 d后提取各组细胞总RNA，反转录实时定量PCR 检测BMP2、RUNX2、OPN、OCN 等mRNA表达，引物信息见表1。荧光定量PCR反应体系总体积为20 µL，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。由PCR 反应曲线得到ct值，以β-actin为内参，计算相对定量结果。

表1 基因引物及片段长度

1.2.6 Western blotting分析

在成骨诱导16、30 d后提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备12%分离胶和5%浓缩胶加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶电压75 V，分离胶用120 V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，在200 mA条件下转膜1 h。5%的脱脂牛奶（0.5%TBST配），封闭1 h，稀释比例为1∶1 000的一抗孵育过夜，稀释比例为1∶5 000 的二抗孵育30 min。洗膜、曝光、显影定影，Image J软件处理系统分析目标带光密度值。

1.2.7 数据处理

试验数据均以±s表示（n=3），用ANOVA 进行统计学检验，组间比较P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 药物浓度的筛选

2.1.1 淫羊藿苷和人参皂苷Rg1对骨髓间充质干细胞增殖的影响

与对照组相比，加入淫羊藿苷和人参皂苷Rg1 均能够促进细胞增殖，淫羊藿苷的最佳浓度为1µmol／L，人参皂苷Rg1 的最佳浓度为10µmol／L，与对照组相比均有显著差异（P＜0.05）（图1）。

图1 淫羊藿苷和人参皂苷Rg1单体对BMMSCs增殖的影响

2.1.2 最佳配伍浓度的确定

CCK-8 细胞增殖检测结果显示，与对照组相比淫羊藿苷和人参皂苷Rg1配伍组均能够增加细胞增殖能力，并且高于淫羊藿苷和人参皂苷的单体作用，配伍组合中淫羊藿苷1µmol／L 与人参皂苷Rg1 20µmol／L组合促进细胞增殖作用最强，与对照组相比，具有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2 淫羊藿苷和人参皂苷Rg1不同配伍对BMMSCs增殖的影响

2.2 钙化结节分析

成骨诱导16 d 后空白对照组无钙化现象，淫羊藿苷与人参皂苷Rg1 配伍组钙化程度高于其他各组；成骨诱导30 d 后空白对照组发生自分化出现钙化现象，但钙化程度小于其他处理组，淫羊藿苷与人参皂苷Rg1配伍组钙化程度高于其他各组（图2）。

图2 不同处理条件下茜素红染色结果（100x）

2.3 实时荧光定量PCR分析

与诱导16 d相比，诱导30 d细胞BMP2、Runx2、OSX以及OPN mRNA的表达水平均呈上升趋势。在诱导16 d和30 d后，与空白对照组及经典成骨对照组相比，淫羊藿苷单体组、人参皂苷Rg1单体组、联合用药组均能够增加BMP2、Runx2、OSX 以及OPN mRNA 的表达量，配伍组各基因表达水平高于其他组，且与空白对照组和经典成骨对照组均具有显著差异（P＜0.05）（图3）。

图3 不同处理对BMMSCs成骨相关基因表达的影响

2.4 Western Blotting分析

BMP2、Runx2、OSX 及OPN 蛋白的表达水平随诱导时间增加均呈上升趋势。与空白对照组及经典成骨对照组相比，淫羊藿苷单体组、人参皂苷Rg1 单体组、配伍组均能够增加BMP2、Runx2、OSX 以及OPN 蛋白的表达量，配伍组各蛋白表达水平高于其他组，且与空白对照组和经典成骨对照组均具有显著差异（图4）。

图4 不同处理对BMMSCs成骨相关蛋白表达的影响

3 讨论与结论

在研究淫羊藿苷和人参皂苷Rg1单体对C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖作用时，分别对3 个浓度进行检测，发现淫羊藿苷和人参皂苷Rg1 单体最佳浓度分别为1µmol／L 和10µmol／L，与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。两者交互配比结果表明淫羊藿苷和人参皂苷Rg1配伍均能促进C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖，1 µmol／L 淫羊藿苷和20 µmol／L 人参皂苷Rg1组合效果最佳，细胞增殖大于单体用药，与对照组相比差异显著（P＜0.01）。

在淫羊藿苷浓度固定为1µmol／L，人参皂苷Rg1浓度依次为10、20、40µmol／L时，结果表明：人参皂苷浓度依次增大，并未呈现出量效关系；而是与20µmol／L人参皂苷Rg1 配伍效果最佳，提示配伍量效关系出现了拐点，应进一步细化浓度配伍的测试点，绘制出精密的量效关系图。

文中首次运用淫羊藿苷配伍人参皂苷Rg1研究其在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。加药后各组钙结节的数量均多于空白对照和经典成骨对照，配伍组钙结节分化最为显著，直观地证明了淫羊藿苷配伍人参皂苷Rg1对骨髓间充质干细胞成骨的促进作用。

实时荧光定量PCR 和Western Blotting 分析结果表明，淫羊藿苷配伍人参皂苷Rg1 能够上调骨髓间充质干细胞中BMP2、Runx2、Osx、OPN 等成骨分化标志因子（P＜0.05）。BMP2 作为成骨诱导因子，可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制其向其他类型的细胞分化［9］。Runx2 过表达导致新骨形成［10］。Osx 也是一种重要的调节成骨细胞分化的转录因子，在成骨分化及骨形成过程中起到非常重要的作用［11］。OPN 与成骨分化晚期相关，表达在成熟的成骨细胞中［12］。

综上所述，淫羊藿苷与人参皂苷Rg1 配伍能够增加BMMSCs 成骨能力，这可能与上调成骨因子促进BMMSCs 向成骨分化形成新的骨细胞并且抑制BMMSCs 向其它细胞分化相关。并且淫羊藿苷和人参皂苷Rg1能够显著促进BMMSCs增殖，未见明显的毒性反应，具有良好的治疗骨质疏松症前景。