刘小琳，陈莎莎，黄瑶雁

（闽南科技学院 生命科学与化学学院，福建 泉州 362332）

甘草为豆科甘草属多年生草本植物的干燥根或根茎[1]，为我国传统中药材。甘草含有多种生物活性成分，其中黄酮类化合物具有抑菌、抗炎，抗氧化等作用[2]。而甘草苷是甘草中一种重要的黄酮类化合物，可增加免疫、抗抑郁、抗糖尿病、保护神经等。有研究发现，甘草总黄酮通过改变小鼠肠道菌群和粪便代谢，减轻伊立替康诱导的结肠炎，具有作为化疗佐剂的潜力。甘草总黄酮可通过减轻炎症反应、提高抗氧化活性酶活性等途径来实现小鼠肝组织的修复，减轻肝损伤[3]。甘草苷对UVB诱导的大鼠皮肤损伤具有保护作用，可作为预防UVB损伤的有效药物[4]。

甘草黄酮类活性成分常通过有机溶剂、超声波、微波等方法提取[5]。与上述方法相比，低共熔溶剂（DES）具有低成本、反应快、易合成、可降解、低毒性或非毒性等特点[6]。通过氢键结合的机化合物和离子型化合物可以形成DES[7]。采用DES提取在天然活性成分的提取中应用广泛[8]。研究中的甘草总黄酮和甘草苷活性成分采用超声法，并结合氯化胆碱和乙二醇组成的DES同步提取；采用响应面法优化获得最佳提取工艺，以期探索甘草资源的高效利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草，购自泉州药店；芦丁标准品，Aladdin（上海）有限公司提供；氯化胆碱，Macklin（上海）有限公司提供；乙腈，国药集团化学试剂有限公司提供；乙二醇、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、醋酸铵，西陇化工股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

V-1800PC型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪表公司产品；Agilent 1260型高效液相色谱仪，C18反相色谱柱（20RBAX SB-C18，4.6 mm×150 mm，50 μm），德国安捷伦科技有限公司产品；KQ5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器设备有限公司产品；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器设备厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 DES的制备

根据已有文献报道[9-10]及前期试验结果，选取以氯化胆碱作为氢键受体，乙二醇作为氢键供体，按照1∶4的比例混合，加入一定体积的水，于80℃水浴条件下加热搅拌至完全溶解，形成均匀液体。

1.3.2 原料预处理

取一定量甘草，于60℃下恒温烘干至质量不变，粉碎过筛（40目），得到甘草粉末，避光冷藏（8℃）备用。

1.3.3 提取工艺

取一定量甘草粉末，加入一定含水率的DES混合均匀，于超声功率200 W，恒温条件下水浴浸提，再将混合液离心，取上清液，即甘草提取液。

1.3.4 总黄酮含量的测定

总黄酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[11]测定。根据标准曲线（芦丁）计算甘草黄酮类物质提取量。其中，拟合的回归方程为Y=14.057X-0.016 5，R2=0.999 4。其公式为：

式中：W1——总黄酮提取量，mg/g；

V——提取液体积，mL；

C1——溶液质量浓度，mg/mL；

n——稀释倍数；

m——粉末质量，g。

1.3.5 甘草苷含量的测定

色谱条件：在靳雪飞等人[12]的方法上进行条件改动，选用C18反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，50 μm）；流动相：乙腈（A）0.03 mmol/L，醋酸铵（B）；梯度洗脱（0~6.0 min，18%~24%A，82%~76%B；6.0~12.0 min，24%~35%A，76%~65%B；12.0~20.0 min，35%~70%A，65%~30%B），体积流量1.0 mL/min，柱温28℃，检测波长327 μm（0~5 min），进样量20 μL。

测定方法配制0.02 mg/mL的甘草苷标准品溶液，依次取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL标准品溶液于容量瓶定容至25 mL，取20 μL进样检测。以标准品溶液甘草苷质量浓度（X，μg/μL）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。拟合的回归方程为Y=14 451X+134.78，R2=0.999 3。对照甘草苷标准曲线得出提取液中甘草苷量，计算出甘草提取液中甘草苷的提取量。其公式为：

式中：W2——甘草苷提取量，mg/g；

C2——高效液相测定的提取液甘草苷质量浓度，μg/μL；

V——提取液体积，mL；

m——甘草粉末质量，g。

1.3.6 优化试验

在前期已完成的单因素试验基础上，设计响应面，选取4个自变量依次是DESs含水率（A）、料液比（B）、超声温度（C）、超声时间（D），选取2个响应值依次是甘草总黄酮提取量、甘草苷提取量。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.3.7 数据处理

响应面试验设计分析使用Design Expert 11.0软件。其中，“*”表示差异显著p＜0.05，“**”表示差异极显著p＜0.01。试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 响应面分析结果

响应面分析试验结果见表2。

表2 响应面分析试验结果

2.2 总黄酮提取量回归模型方差分析

依据2.1试验结果，建立关于4个影响因素A，B，C，D与总黄酮提取量（Y1）之间的多元二次回归模型，得到方程如下：

总黄酮提取量回归方程的R2=0.934 5，说明有93.45%的响应面值符合此模型，试验因素影响较大，相关性高；R2adj为0.869 1，说明有86.91%的试验数据变化可用此模型作参考；精密度值为12.75，说明方程有好的拟合效果；变异系数为2.87%，说明此方程具有较高的合理性。

响应面试验回归模型方差分析见表3。

表3 响应面试验回归模型方差分析

由表3可知，失拟项p=0.396 8＞0.05，说明该模型具有较高的拟合度，选择总黄酮提取量与各因素之间关系科学合理；该模型方程p＜0.000 1，说明该模型显著性极好。据F值可知，4个影响因素对总黄酮提取量的影响顺序由大到小为超声温度＞DESs含水率＞料液比＞超声时间。

2.3 甘草苷提取量回归模型方差分析

依据2.1试验结果，建立关于4个影响因素A，B，C，D与甘草苷提取量（Y2）之间的多元二次回归模型，得到方程如下：

甘草苷提取量回归方程的R2=0.976 0，说明有97.60%的响应面值符合此模型，试验因素影响较大，相关性高；R2adj为0.951 9，说明有95.19%的试验数据变化可用此模型作参考；精密度值为22.60，说明方程有较好的拟合效果；变异系数为1.94%，说明此方程具有较高的合理性。

响应面试验回归模型方差分析见表4。

表4 响应面试验回归模型方差分析

失拟项p=0.892 1＞0.05，说明该模型具有较高的拟合度，选择甘草苷提取量与各因素之间关系科学合理；该模型方程p＜0.01，说明该模型显著性极好；据F值可知，4个影响因素对甘草苷提取量的影响顺序由大到小为DESs含水率＞超声温度＞料液比＞超声时间。

2.4 最佳组合工艺的确定及验证

综合分析回归方程及三维响应面图，得出甘草总黄酮和甘草苷的最优提取工艺条件为DESs含水率41.677%，料液比1∶52.44（g∶mL），超声温度62.376℃，超声时间39.953 min。为了方便验证模型的有效性，取DESs含水率41.7%，料液比1∶52.4（g∶mL），超声温度62.5℃，超声时间40 min。在超声功率200 W条件下得到总黄酮和甘草苷提取量依次为26.83 mg/g和10.73 mg/g，与响应面模型预测值26.912 mg/g和10.746 mg/g非常接近，说明该回归方程可行。

3 结论

研究表明，李志英等人[13]采用超声辅助双水相系统提取甘草总黄酮，提取量为1.96 %；何自强等人[14]采用超声辅助碱性乙醇浸提法提取甘草总黄酮，提取量为2.1%。试验采用超声辅助低共熔溶剂（氯化胆碱-乙二醇）提取甘草活性成分总黄酮和甘草苷，在超声功率200 W，低共熔溶剂含水率41.7%，料液比1∶52.4（g∶mL），超声温度62.5℃，超声时间40 min的条件下得到总黄酮和甘草苷的提取量最高，依次为26.832 mg/g（2.68%）和10.727 mg/g，总黄酮提取量高于碱性乙醇法提取和双水相系统提取。该方法可行且更绿色环保，为甘草资源的综合开发利用提供了一定的理论依据。