任嘉彦， 丁文婧， 王忠敏， 何静文， 尚晓玲

(长春中医药大学， 长春 130117)

多发性硬化症(multiple sclerosis, MS)是中枢神经系统的一种炎性脱髓鞘疾病[1，2]，以神经功能的缺损进而导致残疾为特征[3]。目前认为，该病的发病机制与星形胶质细胞、T细胞自身免疫反应等关系密切[4，5]。急性期多采用短疗程大剂量糖皮质激素冲击疗法，如甲基强的松龙冲击治疗、泼尼松口服等，减轻急性发作症状。缓解期以疾病修正治疗药物如特立氟胺、重组人干扰素β-1b控制疾病进展，预防复发。

益肾达络饮由古方地黄饮子化裁而来，由熟地黄、当归、栀子、豨莶草、石菖蒲、粉萆薢、甘草、鹿角胶7味中药构成。前期实验证明，益肾达络饮可通过多条信号通路改善多发性硬化的症状，如抑制细胞外调节激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2, ERK1/2)通路[6]的激活，抑制酪氨酸激酶(janus kinase, JAK)-信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信号传导通路[6]，调节辅助性T细胞1/2(T helper cell 1/T helper cell 1, Th1/Th2)平衡[7]，降低炎症因子白细胞介素(interleukin, IL)2、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)α、趋化因子-12(CXC chem okine ligand-12, CXCL12)[8]、趋化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1, MCP-1)[9]的释放等。还通过促进神经元的发育、再生及突触形成发挥治疗作用，如升高环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的磷酸化水平[10]等。本研究应用网络药理学方法，对益肾达络饮的主要活性成分、作用靶点及信号通路进行分析，并经初步实验验证，揭示了本复方治疗多发性硬化的作用机制，为进一步的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料库

表1示，本文所涉及的资料库。

1.2 益肾达络饮活性成分和靶点预测筛选

活性成分查于TCMSP[11]，设置Oralbiovavail-ability(OB)≥0.3，drug-likeness(DL)≥0.18，再用Uniport库[12]检索靶点的基因名。

1.3 多发性硬化疾病靶点的筛选

通过GeneCards[13]、OMIM[14]、PharmGkb[15]、TTD[16]、Drugbank[17]数据库，“Mutiple Sclerosis”为关键词，获得疾病靶点合并去重。

1.4 益肾达络饮和多发性硬化的共同靶点筛选

采用Cytoscape 3.8.0软件，将1.2取交集，“VennDiagram”制作韦恩图，得到药物-疾病共同靶点(潜在靶点)。

1.5 调控网络构建

根据1.4得到的交集靶点，使用cytoscape3.8.0软件中的Network功能进行可视化调控网络分析，度值(Degree)与节点呈正比，得到调控网络图，并筛选出该网络中重要的活性成分。

1.6 蛋白互作网络构建

将1.4的交集靶点输STRING库[18](minimum required interaction score>0.9)，构建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)[19]，再导入Cytoscape3.8.0，CytoNCA对节点分析，连接靶点多的节点为关键靶点，介度(Betweeness)、紧密度(Closeness)、节点连接度(Degree)、特征向量(Eigenvector)、局部平均连通度(LAC)、网络(Network)均大于中位值过滤。

1.7 GO、KEGG分析

通过R(4.0.4版本)软件GO分析[20]，将药物-疾病交集基因以P<0.5、Benjamini<0.5为参数进行富集显示。KEGG[21]通路富集以交集基因P<0.5、FDR<0.05为参数。

1.8 分子对接验证

PubChem[22]下载小分子配体2 D结构，通过ChemBio3D Ultra(14.0.0.117)将2 D结构转换为3D并进行优化；PDB库[23]下载3 D受体，PyMOL删除水和小分子配体；借助Auto Dock Tools将配体加氢，确定活性口袋。Vina软件完成结合位置确定，并计算自由能，再利用PyMol软件绘制最优对接结果图。

1.9 动物及主要试剂

1.9.1 动物 SPF级C57BL/6雌雄鼠，购自辽宁长生公司，实验动物许可证号SCXK(吉)2020-0001。饲养、繁殖于长春中医药大学动物实验中心，用以繁殖乳鼠。

1.9.2 含药血清 将C57BL/6雌鼠随机分5组，空白组20只，中药高中低剂量、激素组各10只。高、中、低3组小鼠分别以4 g/(kg·d)、2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)剂量的益肾达络饮药液进行灌胃，激素组用醋酸泼尼松龙片悬浊液0.2 mL/次[0.078 mg/(kg·d)，空白组等量0.9%氯化钠溶液]，灌胃7 d眼球取血，3900 r/min离心10 min取血清，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤膜除菌，-20 ℃保存。

1.9.3 主要试剂 0.25%胰酶(Gibico公司，25200072)；DMEM/F12培养基(Hyclone公司，SH30023.01B)；4%多聚甲醛(上海源叶公司，R20497)；细胞增殖及毒性检测试剂盒CCK-8(bioss公司，BA00208)；DAPI染色液(C02-04002)、曲拉通X-100(C03-03002)、抗荧光淬灭封片液/抗荧光衰减封片剂(C02-04003)、FITC抗体标记试剂盒(bioss公司，bs-0295G)；脂多糖(L2880-10 mg，Sigma公司)；TNF-α、IL-1βELISA盒(睿信生物CK202112M,CK203063M)；中药饮片益肾达络饮购自吉林同仁大药房(长春迅驰广场店)。

1.10 星形胶质细胞的分离、原代培养及鉴定

原代提取星形胶质细胞(astrocytes, AST)是参照参考文献[14]中使用的方案，经纯化、传代后，采用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞纯度。

1.11 益肾达络饮含药血清对LPS诱导的星形胶质细胞活力的影响

96孔板中，细胞以9×103个/孔接种，5组3复孔分别加入的试剂为空白组10%空白血清，模型组10%空白血清，益肾达络饮高剂量组、益肾达络饮中剂量组、益肾达络饮低剂量组和醋酸泼尼松龙对照组分别加入对应10%含药血清，作用12 h后，除空白组其他各组再加入1 μg/mL LPS作用24 h，加CCK-8液10 μL/孔2 h，450 nm检测吸光度(OD)值。细胞活性=(OD对照组 -OD对照空白孔)/(OD空白组 -OD空白孔)×100%。

1.12 对炎症因子TNF-α、IL-1β水平的影响

按照1.11分组和处理收集上清，按照试剂盒说明书检测TNF-α和IL-1β水平。

1.13 统计学方法

2 结果

2.1 益肾达络饮活性成分和靶点预测筛选

经TCMSP库筛选得到方剂中7味中药的活性成分，分别为熟地黄2个，当归2个，粉萆薢2个，石菖蒲4个，豨莶草7个，栀子15个，甘草92个，其中鹿角胶因无有效预测靶点被剔除，筛选出益肾达络饮的124个活性成分，重合活性成分5个，分别为当归、豨莶草、栀子共有的β-谷甾醇(beta-sitosterol)，当归、熟地黄、豨莶草、栀子重合活性成分为豆甾醇(stigmasterol)，石菖蒲、栀子、甘草重合活性成分为山柰酚(kaempferol)，熟地黄、甘草重合活性成分为谷甾醇(sitosterol)，栀子、甘草重合活性成分为槲皮素(quercetin)，合并去重最终筛选出益肾达络饮的115个活性成分，其主要活性成分对应的作用靶点225个(见表2)。

表2 益肾达络饮主要活性成分基本信息比较

2.2 多发性硬化症的靶点预测

图1示，经检索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、Drugbank数据库合并得到关于多发性硬化的8098个疾病靶点。

图1 多发性硬化疾病靶点图

2.3 共同靶点筛选

图2示，益肾达络饮中的225个靶点与多发性硬化8098个靶点进行韦恩图绘制，得到199个交集靶点，即为益肾达络饮活性成分治疗多发性硬化的潜在靶点。

注：Disease表示多发性硬化疾病，Drug表示益肾达络饮方剂，两圆共同部分显示199个共同靶点图2 益肾达络饮和多发性硬化的共同靶点韦恩图

2.4 调控网络构建

图3示，益肾达络饮活性成分-多发性硬化疾病靶点调控网络图，分析得到309个节点1589个关系，中间部分黄色长方形代表199个靶点基因，外周圆圈表示活性成分，绿色表示甘草，蓝色表示粉萆薢，橙色代表豨莶草，粉色代表石菖蒲，紫色圆圈代表栀子，靛青色代表熟地黄，红色代表当归，共有成分用多色表示，根据degree值大小排序，筛选出该网络中节点最多的活性成分前10位。

图3 益肾达络饮活性成分治疗多发性硬化的调控网络图

表3 益肾达络饮重要活性成分的基本信息

2.5 蛋白互作网络构建

图4示，益肾达络饮治疗多发性硬化的PPI网络，得到作用靶点198个，靶点与靶点之间的相互关系达779条。图5示，经CytoNCA插件进一步查找网络核心，该网络的Betweenness中位值为62.4，Closeness的中位值为0.1，Degree的中位值为7，Eigenvector的中位值为 0.03，LAC的中位值为2.8，Network的中位值为3.7，筛选6个过滤条件均大于中位数的为关键靶点，用黄色方框表示，得到的基因共计51个，即51个节点338条边。在此基础上，再次按照6个过滤条件提取分析，得到各条件的中位值分别为Betweenness: 18.6，Closeness: 0.5，Degree: 11，Eigenvector: 0.1，LAC: 5.875，Network: 7.1，得到关键靶点17个176条边，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、TNF、细胞肿瘤抗原p53(Tumor Protein P53, TP53)等。

图4 益肾达络饮-多发性硬化PPI网络图

图5 益肾达络饮-多发性硬化PPI核心网络图

2.6 GO富集分析

图6示，GO富集分析以P<0.05为条件，得到富集结果2574个，其中生物过程2254个，细胞组成98个，分子功能222个，选择前10个绘制，表明益肾达络饮治疗多发性硬化的生物过程主要与炎症、氧化应激和化学激反应相关；细胞组成富集显示，与类固醇激素受体、磷酸酶结合、细胞因子受体结合等方面相关。

注：颜色P值红→蓝递增，横坐标-数目，BP-生物过程、CC-细胞组成和MF-分子功能图6 益肾达络饮-多发性硬化GO富集分析图

2.7 KEGG富集分析

图7示，KEGG富集分析以P<0.5为条件，通路富集结果得到178条通路，主要与炎症、细胞生长、分化、应激与凋亡反应、缺氧反应、免疫反应有关，涉及磷酸肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway, PI3K/AKT)、MAPK、IL-17、TNF、肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, Ras)、环化腺核苷一磷酸(cyclized adenosine monophosphate, cAMP)等信号通路。在TNF信号通路中，有26个靶点参与，关键靶点为JUN、AKT、TNF。益肾达络饮重要靶点TNF参与了包括MAPK、IL-17等60条通路，参与调节多发性硬化免疫细胞及炎症反应及中枢神经髓鞘损伤等。图8示，选择其中重要的TNF通路绘制通路图。

注：颜色P值红→蓝递增，横坐标-基因比例，圆圈大小-基因的数目图7 益肾达络饮-多发性硬化KEGG通路分析(排名前30)

2.8 分子对接验证结果

将2.4得出益肾达络饮重要活性成分，考虑中药本身及复方治疗多发性硬化作用，选取甘草、栀子的共有成分槲皮素(quercetin)，甘草、石菖蒲、栀子共有成分山柰酚(kaempferol)作为核心成分，即小分子配体。综合2.5 PPI网络以及GO和KEGG得到的关键靶点，根据多发性硬化疾病特点选取TNF-α作为核心靶点即受体，再通过分子对接进行初步验证。通过结合能(affinity)评估对接结果，affinity越小表示分子对接结合效果越好。

注：图中的矩形框为一种基因/蛋白质节点，红色为益肾达络饮关键作用靶蛋白图8 KEGG通路TNF信号通路模式图

2个小分子配体(MOL000098、MOL000422)与受体TNF进行模拟对接结果显示，quercetin-TNF结合能为-4.8(kcal/mol)，kaempferol-TNF结合能为-4.1(kcal/mol)，表明quercetin、kaempferol与TNF均有较强的结合活性，初步验证了网络药理学的挖掘结果。图9、10示，借助PyMol软件将对接结果进行可视化。

图9 槲皮素(quercetin)与TNF对接

图10 山柰酚(kaempferol)与TNF对接

2.9 星形胶质细胞的鉴定

原代培养的小鼠大脑皮质星形胶质细胞24 h后大多数星形胶质、神经元开始贴壁，约7 d后形态上星形胶质细胞呈聚集性生长，边缘不易辦认，为多角形后逐渐开始铺展，细胞体增大，部分细胞突起伸长呈梭形，伪足增多，细胞更加透明，胶质细胞基本满瓶底，约10 d时细胞开始分层。图11示，经纯化和GFAP免疫荧光鉴定后，星形胶质细胞形态明显，多呈梭形，GFAP表达主要位于胞浆和突起内，阳性细胞数为95%以上，可以用于接下来的实验。

注：绿色-GFAP阳性；蓝色-DAPI细胞核，星形胶质细胞纯度=星形胶质细胞数/细胞总数×100%。N=3；Scale bar=100 μm图11 星形胶质细胞鉴定

2.10 益肾达络饮含药血清对LPS诱导的星形胶质活性能力的影响

表4示，采用1 μg/mL LPS造成炎症环境模型，测定细胞的活性能力。与空白组比较，模型组活性显著升高；与模型组比较，益肾达络饮高剂量组和醋酸泼尼松对照组增殖活性均显著升高(P<0.01)，益肾达络饮中、低剂量组细胞活性升高(P<0.05)。

表4 星形胶质细胞活性

2.11 益肾达络饮对LPS诱导的星形胶质细胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的影响

图12、13示，模型组与空白组比较(P<0.01)，TNF-α、IL-1β水平明显升高；益肾达络饮低、中、高剂量组与模型组比较(P<0.01)，均能显著降低TNF-α、IL-1β水平，且益肾达络饮高剂量组效果更为明显，表明益肾达络饮能够降低LPS诱导的星形胶质细胞炎性反应。

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05图12 益肾达络饮对星形胶质细胞TNF-α表达影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01；与模型组比较，*P<0.05图13 益肾达络饮对星形胶质细胞IL-1β表达影响

3 讨论

MS好发于中青年，以女性较为多见，主要侵犯中枢神经系统的白质，具有病变部位广泛、症状复杂多变的特点。目前急性期治疗以冲击糖皮质激素为主，控制缓解期复发是重点，不仅费用高且疗效差。中医认为多发性硬化与督脉和脑关系密切。本团队在多年临床经验积累中，认为多发性硬化的病机为肾阳虚、虚生毒、毒入络、络病生。基于此，创立了中药复方益肾达络饮，方中熟地黄、鹿角胶、杜仲可益肾填精，栀子、石菖蒲解毒化浊，郁金、粉萆薢解郁通络，充分体现中医“补泻兼施，调和阴阳”的思想[24]。

本研究筛选出益肾达络饮中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等重要活性成分。已有研究表明，槲皮素有促进髓鞘再生、保护小鼠神经髓鞘损伤的作用[25]，通过抑制小胶质细胞衍生的氧化应激反应和炎症反应，有效减轻小鼠的认知、运动功能缺陷，提示其对神经损伤有治疗作用[26]。山柰酚是一种黄酮类化合物[27]，主要来源于蔬菜及水果[28]。山柰酚及其苷类可能对神经退行性疾病的治疗有益[29]，其能抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和STAT3活化，从而减轻中枢神经系统炎症[30]，β-谷甾醇可有效调节促/抗炎细胞因子[31]。益肾达络饮治疗多发性硬化的关键靶点MAPK、AKT、TNF、STAT3等17个。MAPK信号转导通路家族成员中的ERK1/2、P38、SAPK/JNK等[32-34]，在多发性硬化中发挥重要作用。已有研究表明，过度激活的MAPK可导致小胶质细胞功能障碍，从而导致神经脱髓鞘[35]。原发性星形胶质细胞中Src/MAPK/PI3K/NF-κB通路与多发性硬化的关系密切[36]；在复发-缓解型多发性硬化症患者的CD4+T和调节性T细胞(regulatory cells, Tregs)中，AKT表达水平被抑制[37]，STAT3基因表达增加[38]；TNF基因位点的变异引起多发性硬化患病率增高[39]，TNF-α、IL-17等炎症因子可以启动脑内免疫应答，直接或间接损害中枢神经系统的髓鞘，介导多发性硬化的发病。团队前期工作也证明，本复方具有降低TNF-α[40]表达的作用。

GO、KEGG通路分析结果显示，益肾达络饮治疗多发性硬化的生物学进程主要集中在炎症反应、氧化应激反应等。炎症反应和氧化应激关系紧密，两者在恶性循环中相互关联，氧化应激和抗氧化能力的生物标志物可以作为评估多发性硬化患者炎症状态的潜在工具。PI3K/AKT信号通路可促进轴突再生[41]和轴突髓鞘形成[42]，PI3K/AKT/Fox01通路可抑制IL-17和转录因子孤核受体(orphan nuclear receptor, RORγt)的表达，达到治疗多发性硬化的目的。

分子对接结果可知，益肾达络饮进入机体后能与相关受体有较好的亲和力，同时也进一步证明本文中预测益肾达络饮成分与多发性硬化靶点的可靠性。

星形胶质细胞在多发性硬化变化发展中有着双向作用，既有积极性作用，分泌有利于中枢神经恢复的因子促进神经生长和修复等，又有抑制性作用，增加分泌IL-1β、IL-6，TNF等致炎因子和趋化因子，这些物质对神经细胞具有毒性作用[43，44]。在致炎因素作用下，星形胶质被活化成反应性星形胶质，细胞肥大、增殖异常等[45，46]，反应性星形胶质细胞可诱导Th0向Th1或Th17转化，而Th1或Th17又可分泌一系列炎症因子，引发正反馈式的炎症级联反应[47]，启动脑内免疫应答。已有研究表明，LPS可诱导星形胶质细胞活化[48]，模拟中枢炎症反应。体外实验中，益肾达络饮的高、中、低剂量组均对LPS诱导的星形胶质细胞炎性损伤起到一定的保护作用，可降低TNF-α、IL-1β的分泌(P<0.01)，说明益肾达络饮可能通过发挥抗炎作用而达到治疗多发性硬化的目的，且在分子对接中TNF-α与益肾达络饮重要活性成分(MOL000098槲皮素，MOL000422山柰酚)有较好的亲和力。

综上所述，本研究筛选出益肾达络饮通过MAPK、AKT、TNF等关键靶点参与PI3K-AKT、MAPK、IL-17、TNF-α等多条通路发挥抗炎、调节免疫应答和促进轴突再生和髓鞘形成作用。进一步证明，益肾达络饮的活性成分可通过多种生物学变化影响多发性硬化的发生发展。并从体外实验验证，该方剂对多发性硬化潜在靶点的影响，为该方剂治疗本病提供了机制研究思路。