张海珍,杨文俊,杨正根

（广州康盛生物科技股份有限公司，广东 广州，510660）

金黄色葡萄球菌蛋白A 能与人类及多种哺乳动物血清中免疫球蛋白分子的Fc 段特异性结合，在抗体纯化用亲和层析介质［1,2］及医学领域均有广泛的应用［1］。为防止蛋白A 溶液在冷藏或常温储存过程中可能发生的微生物污染、延长保存时间，需要在保存液中加入抑菌剂。聚已亚甲基盐酸（PHMB）是目前公认的较安全的抑菌剂［3］，对细菌和真菌的杀灭效果均较好［4-5］,被广泛用于新型抑菌材料的研发［6-8］。本文对PHMB 不同浓度及不同时间处理后，重组蛋白A 溶液中的菌数下降情况进行比较研究，以期为同类重组蛋白制品中抑菌剂的选择提供参考。

一、材料与方法

（一）材料与仪器

大 肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10104〕、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕及黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC（F）98003〕均为购买自中国药品生物制品检定所的标准菌株，菌数传代为第二代。胰蛋白胨大豆肉汤（琼脂）培养基、沙氏葡萄糖（琼脂）培养基、氯化钠-蛋白胨缓冲液为广东环凯微生物科技有限公司生产。PHMB（20%）购自广州市拓瑞化工科技有限公司；BCA 试剂盒购自Thermo 公司；琼脂糖购自GE公司；高碘酸钠购自天津福晨化学试剂厂；重组蛋白A 溶液、人IgG 溶液、PBS 溶液、洗脱溶液由本实验室制备。

实验仪器有ZQWY-200N 型卧式恒温振荡器（上海知楚仪器有限公司）、UV-2600 型紫外分光光度计（日本岛津）和LRHS-205F-11 恒湿恒温培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）。

（二）实验方法

1.菌液的制备

将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌甘油菌接种至20 ml 胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，离心收集菌体，然后用0.9 %无菌氯化钠溶液稀释并制成108cfu/ml 的菌悬液。白色念珠菌甘油菌接种至20 ml 沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃培养48 h，离心收集菌体，然后用0.9 %无菌氯化钠溶液稀释并制成108cfu/ml 的菌悬液。黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基，25 ℃培养5～7 d，然后用含0.05 %聚山梨酯80 的0.9 %无菌氯化钠溶液将表面的孢子洗脱，制成108cfu/ml 的孢子悬液。各菌株的菌悬液同时用平皿法作活菌计数。

2.供试液的制备

取广州康盛生物科技有限公司生产的无菌无热原的重组蛋白A 溶液，用无菌生理盐水稀释至终浓度约5 mg/ml，分装至储液瓶中，然后加入PHMB溶液。

3.计数方法验证

采用培养基稀释法消除供试液的抑菌活性。分别加入相应溶液于无菌平皿后，立即倾入温度不超过 45 ℃的琼脂培养基，混匀凝固，倒置培养，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。细菌使用胰蛋白胨大豆琼脂培养基，35 ℃培养24 h；真菌使用沙氏葡萄糖琼脂培养基,其中白色念珠菌25 ℃培养48 h，黑曲霉25 ℃培养5～7d。

（1）试验组：取制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使供试液中含菌量不大于100 cfu/ml。

（2）供试品对照组：取制备好的供试液，以生理盐水代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组：以生理盐水替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值应不小于菌液对照组菌落数值的50%。

4.抑菌效力测定

将含PHMB 的供试液分装于无菌储液瓶中，每瓶100ml，按接菌量105～106cfu 接入各个菌株的菌悬液或孢子悬液。充分摇匀后，从三角瓶中取出1 ml，用氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释10-3～10-5后倒平板，得到0 时溶液中的初始菌落数。然后放置不同时间后分别从三角瓶中取样1ml，采取平皿法计数。其中，每个稀释度2 个重复，计算平均菌落数。2020版中国药典［9］规定抑菌效力判断标准见表1，应符合A 的抑菌效力。

表1 抑菌效力测定标准

5.重组蛋白A 溶液稳定性测定

在重组蛋白A 溶液中加入PHMB，使其终浓度为0.15%（1.5 g/L），常温放置（10～30 ℃）12 个月，分别在0、3、6、9、12 个月取出部分样品，测定蛋白浓度及蛋白活性以考察蛋白的稳定性。其中，蛋白浓度用BCA 试剂盒进行测定。蛋白活性的测定是将重组蛋白A 偶联至琼脂糖Sepharose 6FF 上，评价免疫吸附材料的吸附性能。

吸附剂的合成：取5 ml 琼脂糖凝胶用50 ml 纯化水清洗后与20 ml 浓度为0.05 mol/L 的高碘酸钠溶液混合置于三角瓶中，30 ℃，150 rpm避光反应3 h，用50 ml 的纯化水洗涤；然后加入10 ml 的重组蛋白A 溶液（pH 8.4 的硼酸盐缓冲液），30 ℃，150 rpm 避光反应4 h，用50 ml的纯化水清洗；加入10 ml pH 7.6的磷酸盐缓冲液及2.5 ml 乙醇胺溶液进行封端，于30 ℃、150 rpm 避光反应1 h；最后分3 次加入0.1 g的硼氢化钠还原12 h；用50 ml 的纯化水清洗即可。

吸附性能的测定采用静态吸附法：取合成的吸附剂1 ml 于一次性层析柱中，用20 ml 的PBS 溶液平衡后，加入45 mg 的人 IgG 溶液，28 ℃、120 rpm 吸附1 h，然后加入8 ml 洗脱溶液，28 ℃、120 rpm 洗脱15 min，收集洗脱液。用可见紫外分光光度计在200～400 nm 进行图谱扫描，记录278 nm 处的吸光度，即OD278。

吸附性能（mg/ml）=（(OD278×V洗脱（ml）×稀释倍数）/1.38

注：1.38 为IgG 质量浓度标准曲线测定系数。

二、结果与分析

（一）计数方法验证

通过测定，按照试验组的菌回收率大于50 %的要求，当PHMB 浓度为0.04 %时，大肠埃希菌至少需要稀释100 倍才能消除抑菌作用；铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉至少需要稀释400 倍消除抑菌作用；金黄色葡萄球菌至少需要稀释1000 倍才能消除抑菌作用。当PHMB 浓度为0.15 %至少需要稀释1500 倍才能消除抑菌作用（见表2）。

表2 各试验菌株的最低稀释倍数

（二）不同浓度的PHMB 抑菌效力测定

PHMB 对细菌的抑菌作用较强，0.04 % 的PHMB 溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌作用均能达到2020 版药典要求。0.04 %的PHMB 溶液对白色念珠菌的抑菌作用也能达到药典要求，但是对黑曲霉的抑菌作用较弱，无法达到药典要求（见表3）。

表3 不同浓度的PHMB 溶液抑菌效力测定

（二）不同浓度的PHMB 溶液对黑曲霉的抑菌作用

因PHMB 对黑曲霉抑菌作用较弱，单独研究了提高浓度后的抑菌效力。结果表明，当PHMB 浓度提高至0.15%时，对黑曲霉的抑菌效果可以完全满足2020 版药典的要求（见表4）。

表4 较高浓度PHMB 对黑曲霉的抑菌作用

（三）蛋白浓度的测定

按照试剂盒说明书测定不同时间所取样品的蛋白浓度，重组蛋白A 初始浓度为5.04±0.22 mg/ml,放置3 个月后测定蛋白浓度为5.10±0.18 mg/ml,放置6 个月后测定蛋白浓度为4.85±0.11 mg/ml,放置9 个月后测定蛋白浓度为5.11±0.26 mg/ml,放置12个月后测定蛋白浓度为5.12±0.08 mg/ml。放置12个月后，蛋白浓度与初始值相比未下降。用SPSS 9.0软件进行单样本T 检验，测定第3、6、9、12 个月的样品与0 个月的样品差异不显著（P=0.944），在误差范围内认为重组蛋白A 的蛋白浓度未下降（见图1）。

图1 不同时间下蛋白浓度的变化

（四）合成免疫吸附剂吸附性能测定

所合成的免疫吸附剂对人IgG 溶液的静态吸附性能见图2。合成的吸附剂初始吸附性能为29.06±0.37 mg/ml,放置3 个月后测定吸附性能为29.23±0.20 mg/ml,放置6 个月后测定吸附性能为28.72±0.43 mg/ml,放置9 个月后测定吸附性能为28.39±0.37 mg/ml,放置12 个月后测定吸附性能为28.12±0.59 mg/ml，吸附性能下降了3.23 %。用SPSS 9.0 软件进行单样本T 检验，测定第3、6、9、12个月的样品与0 个月的样品差异不显著（P=0.159），说明吸附剂的吸附性能未明显下降，重组蛋白A 的活性下降在可接受范围内，重组蛋白溶液常温放置12 个月后稳定性良好。

图2 不同时间下蛋白活性的变化

三、结论与讨论

抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质。中国药典规定生产企业确定抑菌剂时必须评价抑菌剂的抑菌效力，所有抑菌剂都具有一定的毒性，所以制品中抑菌剂的量应为最低有效剂量［9］。PHMB 杀菌原理是PHMB·HCl 中的胍基有很高的活性，能使聚合物成正电性，很容易被呈负电性的各类细菌、病毒所吸附，从而抑制细菌病毒的分裂功能，使其丧失生殖能力，加上聚合物形成的薄膜堵塞了微生物的呼吸通道，使微生物迅速窒息死亡。PHMB 小鼠急性经口LD50＞5000 mg/kg，属无毒物质，PHMB 是目前最安全无毒高效的消毒剂［3］。本研究通过测定PHMB 作为蛋白溶液中的抑菌剂的抑菌效果，结果显示在低有效浓度为1.5 g/L 时能够完全达到2020版药典规定的A 类抑菌剂抑菌效力的要求，且对蛋白浓度及蛋白活性影响不大，可以作为蛋白溶液的抑菌剂进行推广应用。