不同外源物质处理对油茶叶片抗寒性的影响

2022-02-04张余华吴玲利李建安唐润钰王雅珺

江西农业大学学报 2022年1期

王楠，张余华，吴玲利*，李建安*，唐润钰，王雅珺

（1.中南林业科技大学林学院/经济林育种与栽培国家林业和草原局重点实验室/经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南长沙 410004；2.湖南省南方丘陵山地生态经济林产业工程技术研究中心，湖南长沙 410004；3.江西省井冈山市林业局，江西吉安 343600）

【研究意义】油茶（Camellia oleiferaAbel.）为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）常绿灌木或小乔木，是我国重要的木本食用油料树种，与油桐、核桃和乌桕并称我国4 大木本油料树种[1]。茶油是优质的食用植物油之一，其不饱和脂肪酸含量高达90%，含有角鲨烯、维生素E、甾醇等抗氧化活性物质，具有降血脂、降胆固醇、增强人体免疫力等保健作用[2-3]。发展油茶产业对保障我国粮油安全及山区产业扶贫具有重大意义。油茶是一种自交不亲和性植物，于秋冬季开花，花期经常遭遇连续低温阴冷天气，引起座果率低、产量下降，严重制约了我国油茶产业的健康发展。因此，寻求油茶花期冷冻害防治的有效方法已成为油茶科学研究的重大课题。【前人研究进展】近年来，大量学者研究发现脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、油菜素内酯（BR）等植物生长调节剂在提高植物抗寒性方面效果显著，目前已经在小麦[4]、香梨[5]、玉米[6]、番茄[7]等研究中得到证实，但在提高油茶抗寒性方面的研究还较少。研究表明，喷施适当浓度的外源ABA能够显著缓解低温胁迫的伤害，在提高植物保护酶活性的同时也能够积累较多的游离脯氨酸，从而提高了植物的抗寒性[8]。BR 作为一种新型的植物生长调节剂，可以有效降低低温胁迫下MDA 对细胞膜的毒害作用，进而增强植物的抗寒性[9]。除激素类物质外，Ca2+能够促进植物低温胁迫下的细胞信号转导，诱导抗寒基因表达来提高作物抗寒性[10]。抗寒性是植物对寒冷冻害长期适应的一种遗传特性，主要取决于植物自身的形态结构变化和植物内部的生理生化变化；植物的叶片是最先感受寒冷且对寒冷特别敏感的器官，当受到低温胁迫时，植物叶片会调整自身的形态及组织结构以适应低温带来的影响[11]。前人研究表明，叶片的解剖结构和外部结构都能反映植物的生理适应性，其叶片的面积、厚度、气孔大小以及栅海比、细胞结构紧密度和细胞结构疏松度都与植物抗逆性存在一定的相关性，都可作为评价植物抗寒性的指标[12]。【本研究切入点】目前，国内外关于油茶抗寒性研究主要集中在低温对油茶开花授粉的影响、幼苗抗寒生理响应及品种抗寒性评价等方面，但缺乏花期抗寒相关研究，使得油茶花期冷冻害防御技术仍悬而未决。【拟解决的关键问题】通过对初花期叶片喷施3 种不同外源物质进行研究，探索利用外源物质提高油茶花期叶片抗寒能力的可行性，以期为油茶花期冷冻害防御提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料来自湖南天球三华油茶科技有限公司株洲苗木生产基地，油茶品种为‘华硕’，置于中南林业科技大学生命科学大楼楼顶（湖南长沙，28°10′N，113°23′E）培育，并进行相同的水肥管理。

1.2 试验设计

选取长势一致、生长健壮的4 年生油茶（苗木高度约为80 cm，地径约为1 cm）为试验对象，待其进入初花期后采用10 mmol/L 氯化钙（CaCl2）、0.1 mg/L 油菜素内酯（BR）、10 mg/L 脱落酸（ABA）对其叶片进行喷施处理：于2020 年11 月1 日开始，07:00 气孔刚打开时，喷施上述3 种溶液各1 L，每2 d喷1 次，连续3 次，对照组（CK）喷施清水，以全部叶片均喷施到且液体自然滴落为宜。试验共4 个处理，每个处理设3 个重复，每个重复3 株，总计36 株。喷施后放至6 ℃人工气候室进行低温处理，在低温处理7 d 后采集相同方位的叶片，采样时间在10:00 左右，每个处理采取3 个样，每个样含有3～6 片叶，样品采好后迅速用锡箔纸包住并贴好标签放入液氮中速冻30 min，然后放入超低温冰箱中-80 ℃保存。

1.3 生理指标测定方法

1.3.1 抗氧化酶活性测定测定使用植物超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 检测试剂盒、植物过氧化物酶（POD）ELISA 检测试剂盒、植物多酚氧化酶（PPO）ELISA 检测试剂盒、植物谷胱甘肽还原酶（GR）ELISA检测试剂盒，每个处理重复3次。

1.3.2 叶片可溶性糖含量和蔗糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量测定测定使用植物可溶性糖（s-sugar）ELISA 检测试剂盒、植物蔗糖（sucrose）ELISA 检测试剂盒、植物可溶性蛋白质（s-protein）ELISA 检测试剂盒、脯氨酸（Pro）ELISA检测试剂盒，每个处理重复3次。

1.3.3 叶片激素、丙二醛含量的测定水杨酸（SA）含量的测定使用植物（SA）ELISA检测试剂盒；丙二醛含量的测定使用植物丙二醛（MDA）ELISA检测试剂盒。

1.4 叶片解剖结构的观察

采用常规石蜡切片制作叶片样本，每个处理3次重复，每张切片各观察3个视野，在OLYMPUS-BX53型显微镜及其成像系统下观察、拍照，采用Image-Pro-plus软件测量其叶片厚度（Leaf thickness，TL）、上表皮厚度（Upper epidermal thickness，TUE）、栅栏组织厚度（Palisade tissue thickness，TP）、海绵组织厚度（Spongy tissue thickness，TS）、下表皮厚度（Lower epidermal thickness，TLE），计算栅海比（P/S）=栅栏组织厚度（TP）/海绵组织厚度（TS）、组织结构紧密度（Cell tense ratio，CTR）=栅栏组织厚度（TP）/叶片厚度（TL）×100%；组织结构疏松度（Spongy ratio，SR）=海绵组织厚度（TS）/叶片厚度（TL）×100%；变异系数=（标准差/平均值）×100%。

1.5 数据统计与分析

用SPSS 25 软件进行单因素方差分析，采用（One-way ANOVA）检验其差异显著性，结果均为3 次重复的平均值，用Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片抗氧化酶活性的影响

由图1A 可知，与对照（CK）相比，油茶经BR、ABA、CaCl23种不同外源物质喷施后，叶片的SOD 活性分别提高了223.56%、165.01%、214.93%，其中BR 处理后的SOD 活性最高，其次是CaCl2、ABA 处理。BR处理后的SOD活性显著高于CK和ABA处理，比ABA处理提高了22.09%，但与CaCl2处理间无显著差异。由图1B 所示，PPO 活性最高为ABA 处理，其次是BR、CaCl2处理，比这两种处理分别提高了13.40%、16.57%，差异显著，但这两种处理间差异不显著。

由图1C和图1D可知，经BR、ABA、CaCl23种不同外源物质喷施后，油茶叶片的POD活性和GR活性经ABA 处理后都最高，两种酶活性由大到小顺序均为ABA、CaCl2、BR 和CK 处理。其中ABA 处理后的POD 活性比CaCl2、BR、CK 处理分别提高了7.86%、20.64%和134.00%，差异显著；GR 活性分别提高了13.05%、20.31%和46.83%，但BR与CaCl2处理间差异不显著。

图1 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片抗氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of different exogenous substances on antioxidant enzyme activities in C.oleifera leaves under low temperature stress

2.2 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片可溶性蛋白、脯氨酸、蔗糖、可溶性糖含量的影响

由图2A 可知，在BR、ABA、CaCl2不同外源物质处理后，油茶叶片的可溶性蛋白质含量比对照组（CK）分别提高了72.10%、91.19%、和53.58%，差异显著。其中经ABA 处理后的可溶性蛋白质最高，显著高于BR、CaCl2处理，比BR和CaCl2处理分别提高了11.09%、24.49%。

由图2B 所示，油茶经CaCl2处理后叶片的pro 含量显著高于CK 和BR 处理，比BR 处理提高了55.84%，但CaCl2和ABA 处理间无显著差异。如图2C可知，油茶叶片喷施不同外源物质后的蔗糖含量大小顺序为CaCl2，ABA，BR，CK 处理；CaCl2处理后油茶叶片的的蔗糖含量显著高于BR 和ABA 处理，显著提高了12.24%、7.83%。图2D 表明，CaCl2处理后的可溶性糖含量最高，其次是BR、ABA 处理，比这两种处理分别提高了5.35%、11.40%，但CaCl2和BR处理无显著差异，与ABA处理差异显著。

图2 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片可溶性蛋白、脯氨酸、蔗糖、可溶性糖含量的影响Fig.2 Effects of different exogenous substances on contents of soluble protein，pro，sucrose and soluble sugar in leaves of C.oleifera under low temperature stress

2.3 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片内源激素、丙二醛含量的影响

由图3-A 可知，在BR、ABA、CaCl2喷施后，油茶叶片的SA 含量比对照组（CK）分别提高了8.83%、22.08%、和16.93%，差异显著；其ABA 处理后的水杨酸含量上升最多，显著高于CK、BR 处理，比BR 处理提高了12.18%，但与CaCl2处理间无显著差异。

由图3-B 可知，油茶喷施BR、ABA、CaCl23 种不同外源物质后，叶片的MDA 含量比对照组（CK）分别降低了17.53%、16.98%和34.68%，差异显著。在CaCl2处理后的MDA 含量显著低于BR、ABA 处理，比两者分别降低了20.79%，21.32%，但与这两种处理间无显著差异。

图3 不同外源物质处理对低温胁迫下油茶叶片水杨酸、丙二醛的影响Fig.3 Effects of different exogenous substances on salicylic acid and MDA in C.oleifera leaves under low temperature stress

2.4 各生理指标主成分分析

由表1 可以看出，本试验提取3 个主成分，累计贡献率达到了100%，说明这两个主成分保留了原始数据全部的信息量，因此选取前3个主成分作为评价不同外源物质处理提高油茶抗寒性的综合指标。第一主成分的特征值为8.521，贡献率达到了85.215%，绝对值较大的依次为POD、蔗糖、PPO 和水杨酸，充分说明了抗氧化酶、蔗糖和水杨酸与抗寒性的关系；第二主成分的特征值为0.895，贡献率为8.947%，绝对值较大的依次为丙二醛、GR，主要表明两者是反映植物抗寒性的主要因子；第三主成分的特征值为0.584，贡献率为5.838%，绝对值较大的依次为脯氨酸、SOD。

表1 因子成分矩阵Tab.1 Factor component matrix

根据前3个主成分特征值及因子成分矩阵（表1），计算得出主成分载荷矩阵，如表2所示。然后根据标准化数据及主成分函数公式，计算得出前3个主成分得分Y1、Y2、Y3，如表3所示；最终根据3个主成分的累计贡献率为权重计算出4 个处理的综合得分Y，ABA、CaCl2、BR、CK 4 种处理的综合得分分别为1.79、1.49、0.34、-3.62；由此可知，ABA、CaCl2、BR 3 个处理较CK 而言，综合得分均有所提高，处理效果大小依次为ABA，CaCl2，BR，CK。

表2 主成分载荷矩阵Tab.2 Principal component load matrix

表3 前3个主成分得分Tab.3 Score of the first 3 principal components

2.5 叶片解剖结构的观察

2.5.1 叶片表皮特征比较如表4 所示，在叶片厚度上，4 种处理均差异不显著。与对照相比，油茶经ABA、CaCl2处理后在低温胁迫7 d的叶片栅栏组织厚度有显著差异，而BR处理后的差异不显著。同时从栅海比、组织紧密度、组织疏松度等多项指标综合比较来看，叶片栅栏组织厚度范围平均为157.84～204.70µm，栅海比范围平均为0.63～0.90，组织紧密度范围平均为0.34～0.44，ABA 处理在栅栏组织厚度、栅海比、组织紧密度上均为最大值，组织疏松度为最小值，但均与CaCl2处理间无显著差异。

表4 不同外源物质处理后的油茶叶片组织结构特征比较Tab.4 Comparison of leaf epidermis characteristics of Camellia oleifera treated with different exogenous substances

将不同外源物质处理后的油茶‘华硕’叶片的8项解剖结构指标进行聚类分析，结果如图4所示。由图4 可知，8 项叶片解剖结构指标可聚集为3 类：第1 类包括组织紧密度、组织疏松度、栅海比、上表皮厚度、下表皮厚度；第2类包括栅栏组织、海绵组织厚度；第3类包括叶片厚度。

图4 8项叶片解剖结构指标的聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis result of eight leaf anatomic structure indexes

由表5可知，叶片厚度和海绵组织厚度呈极显著正相关，与栅栏组织厚度呈显著正相关。栅栏组织厚度和CTR、栅海比呈极显著正相关和SR 呈极显著负相关。海绵组织厚度和SR 呈极显著正相关，和栅海比、CTR呈极显著负相关。栅海比和CTR、SR分别呈极显著正相关和负相关。CTR和SR呈极显著负相关。

根据相关指数的大小确定各类指标中的典型指标，相关指数的计算公式为：Ri2=Σr2/（n-1）。式中：Ri2为每类别指标的相关指数；i为某类指标，i=1，2，…n，n为每类指标的个数；r为同类指标中各相关指标间的相关系数。叶片解剖结构指标的相关矩阵见表5，在同一类别指标中，相关指数最大的指标即为该类指标中的典型指标。若相关指数相等，同类指标中选取变异系数最大的指标作为典型指标。根据相关系数计算出的3个类别指标的相关指数，然后根据相关指数大小对其进行排序，结果见表6。由表6可知，3类指标中的典型指标分别为：第1类为栅海比；第2类为栅栏组织厚度；第3类为叶片厚度。

表5 叶片结构指标的相关矩阵Tab.5 Correlative matrix of leaf structure parameters

表6 叶片结构指标的相关指数及排序Tab.6 Correlation indexes and ranking of leaf structure indexes

采用隶属函数法评价不同外源物质处理后的油茶耐寒性；根据筛选的3 项典型指标计算平均隶属度，数值越大则表明其耐寒性越好。由表7 可知，不同外源物质处理后的油茶耐寒性由强到弱依次为ABA，CaCl2，BR，CK。

表7 不同外源物质处理后的油茶耐寒性的综合评价结果Tab.7 Comprehensive evaluation results of cold resistance of Camellia oleifera treated with different exogenous substances

2.5.2 叶肉组织结构特征分析从图5中可以观察到，经ABA、CaCl2处理后的油茶‘华硕’的叶肉结构有三层栅栏层细胞，栅栏组织细胞为较细长的长柱形且排列较为紧密，其与栅栏组织相邻的海绵组织排列较疏松；栅栏层细胞排列越紧密，其耐寒能力越强。而BR 处理和对照组（CK）的叶肉结构只有两层栅栏层，但BR处理的栅栏层明显比CK排列紧密。

图5 不同外源物质处理后油茶‘华硕’叶片的横切面Fig.5 Cross-section of leaves of Camellia oleifera cultivars‘Huashuo’treated with different exogenous substances

3 讨论与结论

3.1 讨论

低温是影响植物生长发育和地理分布的一个重要因子，外源物质处理可以增加抗氧化物质的含量和细胞内渗透调节物质以使植物适应寒冷环境[13]。植物受到低温胁迫时会产生大量的活性氧自由基（ROS），此时植物通过增强抗氧化酶活性迅速清除体内的自由基来减少膜脂化伤害，POD、PPO、GR等作为重要的保护酶可以加强抗氧化作用从而减少低温的伤害提高抗寒性[14]；周琳等[15]研究表明低浓度的ABA处理茶苗有利于抗氧化酶活力的提高从而增强抗逆性。李亮等[16]人发现低温下SA的积累可以在转录水平上促进碳同化关键酶基因的表达，从而减轻低温胁迫对光合作用的抑制来缓解低温胁迫对植株的损伤。从本试验结果来看，油茶喷施3 种外源物质后的叶片POD、PPO、GR 活性和SA 含量显著高于对照，其中10 mg/L ABA 处理均为最大值，由此说明喷施3 种外源物质都提高了油茶叶片的抗寒性，且10 mg/LABA 处理对油茶保护酶活性的增强和提高SA 含量效果最佳，但最适浓度和对其他内源激素的影响还需进一步研究。

MDA 作为膜脂过氧化的产物，其含量可以反映植物受胁迫的程度[17]。而渗透调节是植物逆境胁迫下的主要调节方式，脯氨酸、可溶性糖等作为植物受到胁迫下重要的渗透调节物质，当低温胁迫来临时其含量会显著增加，来维持细胞膜的渗透调节功能以此来适应胁迫环境[18]。本研究发现低温胁迫前用10 mmol/L CaCl2处理后的油茶叶片，MDA 含量显著低于其余两种处理，同时其脯氨酸、蔗糖、可溶性糖含量均最高，表明10 mmol/LCaCl2处理能更有效降低膜脂过氧化的程度和提高渗透调节物质的含量来缓解低温伤害。但由于植物抗逆性是一个复杂的调控过程，且各生理生化指标受到逆境影响和响应的程度也大不相同，利用单一指标去评价植物的抗逆性存在局限性，因而需要应用多种指标去综合评价不同处理对植物逆境的缓解效果。本试验通过对10个生理指标进行主成分分析发现蔗糖作为第一主成分的典型指标贡献率较大，由此说明糖类物质除可溶性糖外蔗糖也可以作为抗寒性评价的重要指标；根据最终的得分表明3种不同外源物质处理均提高了油茶的抗寒性，其中10 mg/LABA处理得分最高，抗寒效果最好。

大量研究表明，除生理生化指标外，植物叶片解剖结构也可以反映植物的抗寒性，栅栏组织厚度越大且排列紧密以及栅海比越大则其耐寒性越好[19-20]。本研究通过聚类分析、相关指数及排序筛选出叶片厚度、栅栏组织厚度、栅海比作为抗寒性的3项典型指标。通过试验结果分析，各处理间油茶叶片厚度差异不显著，这可能是由于材料品种一致且低温胁迫时间较短造成的；与对照相比，油茶叶片喷施不同外源物质后栅栏组织均有所增厚，而从叶片的横切面来看，其中ABA、CaCl2处理比CK、BR处理明显多了一层栅栏组织且排列更为紧密，同时伴随着海绵组织厚度的减少栅海比增加，这说明3 种外源物质处理都提高了油茶叶片的耐寒性。