吴玲，邹凤梅，王欣，魏勤，李军春，刘刚，李可可，王晓宁，张蕾

(甘肃省人民医院检验中心，甘肃省医学检验临床医学研究中心，兰州730000)

根据《伯杰系统细菌学手册》第2版，奈瑟菌属(Neisseria)隶属于β-变形菌纲，奈瑟菌目，奈瑟菌科。奈瑟菌属的细菌对黏膜的亲和力强，可从人体中分离出多个菌种，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、灰色奈瑟菌(N.cinerea)、浅黄奈瑟菌(N.flavescens)、乳糖奈瑟菌(N.Lactamica)、黏膜奈瑟菌(N.mucosa)、多糖奈瑟菌(N.polysaccharea)、干燥奈瑟菌(N.sicca)和微黄奈瑟菌(N.subflava)等多个菌种。一些菌种主要来自于动物，如动物奈瑟菌(N.animalis)、动物口腔奈瑟菌(N.animaloris)、动物咬伤奈瑟菌(N.zoodegmatis，来自猫和犬的咽部)、反消化奈瑟菌(N.denitrificans，来自于豚鼠咽喉)、牙斑奈瑟菌(N.dentiae，来自饲养牛牙斑)、编织奈瑟菌(N.weaveri，来自犬的口腔菌群)和恒河猴奈瑟菌(Neisseriamacacae，来自恒河猴的口咽部)[1]。除脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌外，其余奈瑟菌引起人类感染的报道较少。恒河猴奈瑟菌1983年首次在恒河猴(猕猴)身上被发现[2]，而感染人的报道极为有限。现将从关节窦道穿刺液中分离引起膝关节感染的恒河猴奈瑟菌报道如下。

1 病历摘要

患者女性，76岁，患类风湿关节炎和2型糖尿病，2020年8月行“右膝关节置换术”。术后约8个月，即2021年4月，右膝关节疼痛、肿胀，活动受限，右膝髌骨处可见一长约20 cm的手术瘢痕组织，髌下可见一大小约0.3 cm×0.3 cm未愈窦道，持续有淡黄色液体渗出，局部皮温增高，外院诊断为“右膝关节假体植入感染”，取患者窦道内侧关节腔穿刺液做细菌培养。实验室检查：白细胞计数：6.66×109/L，中性粒细胞百分率：73.3%，红细胞沉降率：80 mm/h，C反应蛋白：98.65 mg/L，白介素-6:64.76 pg/mL，降钙素原：0.18 ng/mL，类风湿因子：138 IU/mL，抗角蛋白抗体：阳性，抗环瓜氨酸肽抗体：>500 U/mL,空腹血糖：6.33 mmol/L。临床诊断：膝关节假体植入感染，类风湿关节炎和2型糖尿病。临床治疗中每日给予患者氯化钠注射液(100 mL)+头孢曲松钠(2 g, ivgtt, q12h)治疗2周，效果显著，病情稳定后出院。

2 细菌的分离培养与鉴定结果

2.1细菌的分离与培养 按照《临床检验操作规程》第4版，用接种环挑取黄色、微浑浊的窦道穿刺液，分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，放入35 ℃、5%CO2培养箱培养；同时窦道穿刺液直接涂片，革兰染色。涂片染色结果：白细胞较多，在白细胞内可见革兰阴性双球菌。培养24 h生长情况：哥伦比亚血琼脂平板上菌落有大小2种，小的约1 mm、大的约2 mm，光滑、湿润、灰白色、无溶血；巧克力琼脂平板上菌落同样有大小2种，菌落大小同哥伦比亚血琼脂平板，光滑、湿润、灰白色。麦康凯琼脂平板未生长；沙氏琼脂平板未生长。培养48 h生长情况：哥伦比亚血琼脂平板与24 h生长情况一致，略有区别的是小菌落约2 mm、大的约3 mm、出现淡淡的黄色素，见图1。巧克力琼脂平板除菌落约增大至2～4 mm外，生长情况同24 h。麦康凯琼脂平板不生长；沙氏琼脂平板未生长。纯菌涂片革兰染色：革兰阴性双球菌。哥伦比亚琼脂平板和巧克力琼脂平板购自郑州安图生物公司，麦康凯琼脂平板和沙氏琼脂平板为实验室自制。

图1 细菌在哥伦比亚血琼脂平板5% CO2环境温育48 h生长情况

2.2细菌鉴定

2.2.1常规鉴定 氧化酶阳性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阴性，β-内酰胺酶试验阳性，以金黄色葡萄球菌ATCC 29213作阳性对照，以金黄色葡萄球菌 ATCC 25923为阴性对照(头孢硝噻酚纸片购自Oxoid公司)；用生物梅里埃奈瑟菌和嗜血杆菌鉴定盒(比色法API NH 10400)进行鉴定，鉴定码为5333，被鉴定为副流感嗜血杆菌，其鉴定%与T值均不显示，表明用此方法不能准确鉴定。

2.2.2质谱技术鉴定 用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术进行鉴定，用BRUKER microflex鉴定，结果为Neisseriamacacae(猴奈瑟菌)，分值2.179；用Autof ms1000鉴定，结果为Neisseriamacacae(恒河猴奈瑟菌)，分值9.6。2种质谱仪鉴定结果一致。

2.2.3靶向DNA测序鉴定 用16S rDNA基因测序鉴定方法：用细菌基因组DNA提取试剂盒DP320(Tiangen公司)提取分离菌株的基因组DNA作为PCR模板，采用27F(5′-AG

AGTTTGATCATGGCTC-3′)和1492R(5′-TAGGGTTACCTTGT

TACGACTT-3′)引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix 15 μL，模板DNA 2.0 μL，10 μmol/L 27F引物1.0 μL，10 μmol/L 1492R引物1.0 μL，ddH2O补足体积至30 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，送北京睿博兴公司进行16S rDNA测序，采用Illumina公司HiSeq 2500型测序仪，将序列提交NCBI数据库中进行BLAST对比鉴定。结果显示，分离株与恒河猴奈瑟菌、黏膜奈瑟菌的相似度均为99.654%：Neisseriamacacae(NR117701.1)99.645%，Neisseriamucosa(NR117696.1)99.645%。

3 药敏试验

因恒河猴奈瑟菌没有可参考的药敏试验判断折点，故参考CLSI M100第32版中表2I脑膜炎奈瑟菌抑菌圈直径和MIC折点[3]。挑取纯培养物配制为0.5 mol/L菌悬液，用棉签蘸取均匀涂布于苛氧菌药敏琼脂平板(STM)上，在室温放置10 min，将待测抗菌药物的E-test条贴在平板上，然后放入35 ℃、5% CO2培养箱温育24 h后观察MIC值。结果显示，青霉素：4.0 μg/mL(R)、头孢曲松：0.048 μg/mL(S)、美罗培南：0.048 μg/mL(S)、米诺环素：1.0 μg/mL(S)、环丙沙星：0.25 μg/mL(R)、左氧氟沙星：1.0 μg/mL(R)、复方磺胺甲噁唑：1.0 μg/mL(R)、氯霉素：4.0 μg/mL(I)、利福平：4.0 μg/mL(R)。其中，药敏试验平板和E-test条均来自于郑州安图生物公司。试验中以ATCC 49619肺炎链球菌和ATCC 25922大肠埃希菌作为质控菌株，所测E-test条MIC值均在质控范围内。

4 结果与讨论

直接涂片革兰染色中观察到，白细胞数量较多、在白细胞内可见革兰阴性双球菌，以此判断该菌为穿刺液中作为病原菌的依据。用实验室现有的常规方法，如生物梅里埃API NH不能准确鉴定，因API系统中没有相关的数据。用MALDI-TOF MS技术可准确鉴定。经靶向DNA测序鉴定，与Neisseriamacacae(NR117701.1)序列相似度为99.645%，与Neisseriamucosa(NR117696.1)为99.645%。鉴定结果与黏膜奈瑟菌无法区别，这与临床微生物学手册中所描述的干燥奈瑟菌和恒河猴奈瑟菌被认为是黏膜奈瑟菌的变种[1]可能有关；恒河猴奈瑟菌和黏膜奈瑟菌对碳水化合物利用试验均能利用葡萄糖、麦芽糖、果糖和蔗糖；但是黏膜奈瑟菌菌落较大、黏着、不产生色素，硝酸盐还原试验阳性；而恒河猴奈瑟菌的菌落与黏膜奈瑟菌菌落比较相对较小，光滑、湿润、且有淡淡光亮的黄色素、随着培养时间的延长其色素更加明显、硝酸盐还原试验阴性。利用这些表型特征和生化试验将两者区别开来，以确定该菌为恒河猴奈瑟菌。

抗菌药物敏感试验应该选择MHA平板，因当时实验室无MHA平板，考虑STM与MHA的基础营养成分基本一致，故选择用STM。根据药敏结果，推荐使用头孢曲松，该菌β-内酰胺酶试验阳性，而头孢曲松对产β-内酰胺酶菌株的脑膜炎奈瑟菌具有高度抗菌活性[4]，而恒河猴奈瑟菌属于奈瑟菌属，推测对其抗菌活性也强，另外消除半衰期长，具有长效作用。临床治疗中每日给予患者氯化钠注射液+头孢曲松钠治疗2周，效果显著，病情稳定后出院。

恒河猴奈瑟菌来自恒河猴的口咽部，这种动物源性奈瑟菌在咬伤人后可导致人伤口感染，该患者未与猴接触过。据文献报道，从人类标本中共分离出恒河猴奈瑟菌10例，其中血培养4例、腹膜透析液1例、口腔1例、咽试子1例、呼吸道3例[5]。而该菌引起膝关节的感染未见报道，而对引起以上感染的途径及机制尚不清楚。恒河猴奈瑟菌是否也是人类上呼吸道的正常菌群，还或许是黏膜奈瑟菌的变种的这些疑惑，还需在今后的工作中求证。

MALDI-TOF MS能鉴定出用常规方法不能准确鉴定的少见菌和罕见菌。本例如果没有直接涂片作为判断病原菌的依据，有可能将恒河猴奈瑟菌当作污染菌。随着鉴定手段的提高，通过涂片来溯源显得尤为重要，只有判断准确，再结合MALDI-TOF MS鉴定，才能在实际工作中发现这些少见菌和罕见菌引起的感染。