徐 军，陈君平，李梦君，程兰兰，王 健

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)已成为有EGFR敏感突变的晚期非小细胞肺癌患者一线治疗的首选药物，但大量患者表现出原发或获得性耐药和肿瘤进展，且目前仍缺乏一致且易检测的疗效、预后预测指标。WHO(2021)肺部肿瘤组织学分类中新增了国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)肺腺癌分级系统，对肺癌手术切除后的预后判断有一定价值[1]。Napsin A是诊断肺腺癌最常用的标志物，也是早期肺癌手术切除后的预后指标[2-4]。有研究报道，Napsin A表达上调可逆转吉非替尼耐药肺癌细胞中的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，恢复细胞对吉非替尼的敏感性[5-6]，由此设想Napsin A表达可能与EGFR-TKIs耐药有关。本实验主要探讨晚期肺腺癌IASLC分级和Napsin A蛋白表达与EGFR-TKIs疗效和患者预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2016年1月～2019年12月间解放军联勤保障部队第九○一医院确诊的563例肺腺癌患者，临床分期为ⅢB～Ⅳ期，均有EGFR基因突变检测结果，排除K-RAS和ALK阳性患者，EGFR敏感突变患者接受EGFR-TKIs一线治疗。收集患者临床病理资料，包括患者年龄、性别、吸烟史等，按照IASLC分级系统(2021)进行组织学分级。同时收集EGFR-TKIs治疗前后均有活检配对的标本20对。本实验获得本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 基因突变扩增阻滞系统(ARMS法)人类EGFR基因21种突变检测试剂盒购自厦门艾德生物公司，所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，6～8 μm厚切片10张以上，应用FFPE样品DNA分类试剂盒提取DNA，将提取好的DNA稀释成2 ng/μL，将42.3 μL稀释好的DNA模板加入2.7 μL Taq酶液混合，分别取5 μL加入到预先分装好的8联管反应液中，离心后用ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，合计15个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20s，合计31个循环，60 ℃收集FAM和HEX信号，进行数据分析。

1.3 免疫组化及结果判定免疫组化染色采用EnVision两步法。兔抗人Napsin A单克隆抗体购自福州迈新公司，石蜡切片脱蜡至水，其余均在BenchMark-GX全自动免疫组化仪(罗氏公司)上进行，分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。Napsin A阳性定位于细胞质，结果判定参考Lee等[3]方法：以阳性细胞数≥10%为阳性，<10%为阴性。

1.4 疗效评价随访及预后分析根据实体瘤的疗效评价标准评价疗效，分为肿瘤完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、稳定(stable disease, SD)和进展(progressive disease, PD)。分别计算客观缓解率(objective response rate, ORR)和疾病控制率(disease control rate, DCR)。无进展生存期(progression-free survival, PFS)定义为患者从接受治疗开始至疾病进展或疾病尚未进展的末次随访时间。总生存期(overall survival, OS)定义为患者从接受治疗开始至因任何原因死亡的时间。随访截至2021年9月31日。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验；单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验，计算患者的PFS和OS，并绘制生存曲线；多因素分析采用Cox比例风险回归分析预后影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征合计563例初治ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌患者接受了EGFR突变检测，敏感突变257例(45.6%)，Napsin A阳性456例(81.0%)，Napsin A在EGFR敏感突变、低IASLC分级肺腺癌中的阳性率高于EGFR无突变、高IASLC分级肺腺癌。125例患者接受了EGFR-TKIs一线治疗，男性48例，女性77例，中位年龄65岁，19del 60例(48%)，L858R突变55例(44%)，少见敏感突变10例(8%)，其中G719X突变5例，19del和L858R突变3例，L861Q 突变1例，L861Q和S768I突变1例；Napsin A阳性106例(84.8%)，Napsin A阳性和阴性患者的基线特征基本平衡(表1)。

表1 Napsin A表达与EGFR突变晚期肺腺癌临床病理特征的关系

2.2 IASLC分级和Napsin A蛋白表达与患者疗效的相关性Napsin A阳性、低IASLC分级患者的ORR明显高于Napsin A阴性、高IASLC分级患者(P<0.001；P=0.002)，Napsin A阳性患者的DCR高于阴性患者，但差异无统计学意义(P=0.066，表2)。

表2 IASLC分级和Napsin A蛋白表达与患者疗效的相关性

CR.完全缓解；PR.部分缓解；SD.稳定；PD.进展；ORR.客观缓解率；DCR.疾病控制率

2.3 影响患者PFS、OS的单因素和多因素分析Kaplan-Meier单因素分析结果显示：患者中位PFS及OS均与Napsin A表达、EGFR突变类型、IASLC分级有关，其中19del组与L858R组(P=0.003)、L858R组与少见敏感突变组(P=0.009)的中位PFS差异均有统计学意义；19del组与L858R突变组的OS无明显差别，但均明显长于少见敏感突变组(P=0.028，图1，表3)。

Cox多因素分析结果显示：IASLC分级(P=0.02)、Napsin A表达(P=0.002)、突变类型(P=0.023)是影响患者PFS的独立因素，同时IASLC分级(P=0.029)、Napsin A表达(P=0.007)也是影响患者OS的独立因素(表4)，提示Napsin A表达缺失、高IASLC分级患者预后不良。

图1 A.Napsin A表达与晚期肺腺癌患者无进展生存率的关系；B.Napsin A表达与晚期肺腺癌患者总生存率的关系；C.IASLC分级与晚期肺腺癌患者无进展生存率的关系；D.IASLC分级与晚期肺腺癌患者总生存率的关系

表3 影响EGFR敏感突变患者接受EGFR-TKIs一线治疗后PFS和OS的单因素分析

2.4 患者接受EGFR-TKIs治疗前后Napsin A表达和IASLC分级变化有20对接受EGFR-TKIs一线治疗前后的配对活检标本纳入研究，二次活检结果示T790M突变9例(45.0%)。3例在EGFR-TKIs治疗后出现Napsin A表达缺失(图2)，这3例肺腺癌组织在EGFR-TKIs治疗前为IASLC Ⅱ级，治疗后均为组织学Ⅲ级，以实性成分为主，其中1例出现了肉瘤样癌组织特征，且表达vimentin；3例患者中19del+T790M突变1例，L858R+T790M突变1例，其余1例未检出T790M突变。

3 讨论

尽管基于影像学和病理诊断的TNM分期是目前指导肺癌治疗、判断预后的主要依据，但存在明显不足：不能精确判断肿瘤的生物学特性，难以发现肿瘤更多的微观变化等，同一TNM分期接受相同治疗的患者生存个体差异较大，提示存在其他独立于传统TNM分期的影响预后因素。EGFR-TKIs已成为EGFR敏感突变晚期非小细胞肺癌患者一线治疗的首选用药[7]，但大量患者耐药，继发T790M点突变和MET基因扩增是TKIs耐药的主要原因，然而其余机制并不清楚，探寻这些影响EGFR-TKIs疗效和预后的分子标志物表达特征，有助于更好地开展肺癌的个体化治疗。

表4 影响EGFR敏感突变患者接受EGFR-TKIs一线治疗后PFS和OS的多因素分析

吉非替尼治疗前吉非替尼治疗后埃克替尼治疗前埃克替尼治疗后HENapsin A

Napsin A常表达于肺腺癌、卵巢透明细胞癌、肾细胞癌、子宫内膜浆液性癌、甲状腺癌等[8-11]，肺腺癌中Napsin A阳性率为70%～90%，是诊断肺腺癌的常用抗体之一，其敏感度和特异性均高于TTF-1(83.0%vs73.0%，87.0%vs64.0%)[2]。既往研究证实Napsin A与肺腺癌患者预后有关。手术切除的肺腺癌中Napsin A阳性更多见于肿瘤直径小、组织学类型为非实性、非黏液类型[3]、无淋巴结转移及胸膜侵犯的患者[12]，生存分析显示肺腺癌中Napsin A阳性患者的总体生存率高于Napsin A阴性患者[3]。相关研究多限于早期手术切除的病例，而Napsin A对晚期肺癌特别是有EGFR敏感突变并接受EGFR-TKIs治疗患者的疗效和预后影响研究较少。本实验结果显示，EGFR敏感突变晚期肺腺癌中Napsin A的阳性率为84.8%，Napsin A阳性与EGFR突变呈正相关，与克罗地亚[13]、韩国[3]、美国[14]学者研究结果基本一致，提示Napsin A表达可以作为预测患者EGFR突变状态的分子标志物，如果Napsin A阴性，取材标本有限，则可以考虑优先检测EGFR之外的其它分子靶点。Napsin A阳性患者的ORR明显高于Napsin A阴性患者，生存分析发现，Napsin A表达是影响患者PFS和OS的独立因素，Napsin A表达缺失的晚期肺腺癌患者预后不良，提示Napsin A还是预测EGFR-TKIs疗效和判断患者预后的标志物。本组下一步可以进行大样本前瞻性随机研究，综合更多患者的生存预后大数据，探讨不同阳性界值对预后的影响，进一步明确Napsin A对临床实施精准个体化治疗的实用价值。

Napsin A在EGFR敏感突变肺腺癌中的作用机制尚不清楚。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，新近研究结果表明EMT和EGFR-TKIs耐药有关[15-16]。有研究发现Napsin A表达水平与厄洛替尼的敏感性呈正相关，Napsin A过表达可抑制TGF-β1诱导的EMT和由EMT介导的厄洛替尼耐药[5-6]。在对吉非替尼耐药的A549-GFT细胞中上调Napsin A表达，可通过抑制integrin信号传导通路逆转EMT，从而使耐药细胞对吉非替尼重新敏感。本实验发现3例患者在发生继发耐药后出现Napsin A表达缺失，其中1例未检出T790M突变，从侧面提示Napsin A可能参与了EGFR-TKIs的继发性耐药，耐药后肺癌组织出现了低分化、肉瘤样特征，提示该过程可能与EMT有关。本实验的局限性在于治疗前后配对样本量偏少，上述假设仍需更多的体内实验研究加以印证，下一步可以探讨Napsin A蛋白表达和基因改变(如基因突变、启动子甲基化等)的关系，以及和下游信号分子、EMT相关分子标志物及integrin信号传导通路的关系，明确Napsin A表达缺失在EMT介导的EGFR-TKIs耐药中的作用。

WHO(2021)胸部肿瘤组织学分类中新增了IASLC肺腺癌分级系统：Ⅰ级以贴壁样为主，<20%高级别模式(实性、微乳头、纤维间质内单个肿瘤细胞浸润)；Ⅱ级以腺泡状、乳头状为主，伴<20%高级别模式；Ⅲ级为任何组织类型伴≥20%高级别模式。以往研究发现肺腺癌组织类型如实性、微乳头状生长方式与预后差有关，Zhang等[17]发现不同生长模式的EGFR突变肺腺癌患者的PFS有差异。Jeon等[1]研究发现IASLC分级与ⅠA期肺腺癌手术切除患者的预后有关。本实验结果显示，低IASLC分级患者的ORR高于IASLC高分级患者，EGFR敏感突变患者接受EGFR-TKIs一线治疗后的中位PFS和OS均与组织学分级有关，IASLC分级是影响患者PFS和OS的独立因素，说明IASLC分级系统能简单、有效地判断EGFR-TKIs的疗效和患者预后，适宜在临床推广应用。

不同EGFR突变状态对于患者的预后价值尚无统一结论。单因素分析表明，19del组与L858R组(P=0.003)、L858R组与少见敏感突变组(P=0.009)的中位PFS差异有统计学意义，与国内[18]及韩国[19]部分研究结果一致。但也有一些回顾性研究结果显示，19del组与L858R组患者的ORR和DCR差异无统计学意义[20]。19del组与L858R组总生存率差异无统计学意义，说明19del组与L858R组主要与患者近期疗效有关，而远期预后差异不明显，一方面可能与OS受后续治疗的影响较大有关，另一方面可能与本实验样本量不足有关。本实验还纳入了10例少见EGFR敏感突变患者的临床资料，其中包括4例联合突变的患者，这种联合突变的靶向药物选择及实际疗效尚缺乏足够的病例研究。对于这类患者给予EGFR-TKIs一线治疗也有一定的疗效，但少见敏感突变组患者的中位PFS和OS均明显低于常见敏感突变组。