胡茹英，刘效栓，肖正国，李季文，李喜香，王雪梅

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要病理表现为关节滑膜的慢性炎症，增生形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。遗传、环境和生活方式是RA的主要影响因素[1-2]。临床对于RA 仍无较满意的治疗手段，目前，以甲氨蝶呤为首选策略[3]。清热除湿止痛方由忍冬藤、络石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龙、木瓜、薏苡仁、槲寄生10 味中药组成，临床应用效果较好。因此，本实验采用层次分析（AHP）-熵权法结合星点设计-效应面试验，优选出清热除湿止痛液的最佳提取工艺，旨在将清热除湿止痛方制备为安全有效、质量可控、使用方便的新制剂。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（1525 型泵、717 型进样器、2487 型双通道紫外检测器，Waters 公司）；CPA-225D 型十万分之一电子天平、BS224S 型万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；98-1-B 型电子恒温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；SB-3200DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZXFD-A5140 型全自动新型鼓风干燥箱微波真空干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；HWS-24 型恒温水浴锅（上海齐欣仪器有限责任公司）。

1.2 试药

对照品绿原酸（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y22M8K36544，纯度≥98%）；龙胆苦苷（北京北纳创联生物技术研究院，批号：190513，纯度≥98%）；络石苷（中国食品药品检定研究院，批号：111858-201603，纯度≥99.5%）；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为娃哈哈矿泉水。

络石藤（批号：171102）、槲寄生（批号：1903040）、秦艽（批号：180902）、薏苡仁（批号：181125）、防己（批号：180801）、木瓜（批号：1712001）、牛膝（批号：180819）、忍冬藤（批号：190202）、桑枝（批号：180301）、地龙（批号：2018001）均购于甘肃省康乐中药饮片有限责任公司，经甘肃省中医院李喜香主任药师鉴定均符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版要求。

2 方法与结果

2.1 提取液的制备

按原处方比例称取忍冬藤、络石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龙、木瓜、薏苡仁、槲寄生10味中药，共65 g，混匀后，按一定料液比加水浸泡，首次煎煮前补足饮片吸水量，煎煮3 次，滤过。合并滤液，浓缩至65 mL，即得清热除湿止痛液水提液，冷藏备用。

2.2 高效液相色谱法（HPLC）测定含量

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Symmetry Shieid™RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，6%～10%A；10～30 min，10%A；30～35 min，10%～23%A；35～50 min，23%A；50～55 min，23%～6%A）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：室温；检测波长：280 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定绿原酸、龙胆苦苷、络石苷对照品适量，分别置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为1.26、1.03、1.17 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密吸取上述各储备液0.485、2.500、1.000 mL至5 mL棕色量瓶中，配制成分别含绿原酸、龙胆苦苷、络石苷0.122、0.515、0.234 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取2.1 项下清热除湿止痛液水提液样品5 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，分次加入甲醇，超声溶解，并转移至10 mL 量瓶中，定容至刻度，摇匀，静置，移取适量上清液稀释4 倍，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。按照2.2.1项下色谱条件进样测定，见图1。

图1 清热除湿止痛液中3个指标成分混合对照品溶液及供试品溶液的HPLC图

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系 精密吸取2.2.2 项下的混合对照品溶液适量，分别进样2、4、6、10、12、16 μL，记录峰面积，计算线性回归方程，结果见表1。

表1 清热除湿止痛液中3个指标成分的线性回归方程、相关系数及线性范围

2.2.4.2 精密度试验 精密吸取2.2.2 项下的混合对照品溶液10 μL，按2.2.1 项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。测得绿原酸、龙胆苦苷、络石苷峰面积RSD 分别为1.227%、0.631%、0.690%，3 种成分的峰面积RSD 均小于3%，表明仪器具有良好的精密度。

2.2.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、12、24 h 进样10 μL测定，记录绿原酸、龙胆苦苷、络石苷的峰面积，结果绿原酸、龙胆苦苷、络石苷峰面积RSD 分别为0.83%、0.45%、1.00%，3 种成分的峰面积RSD 均小于3%，表示供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4.4 重复性试验 按2.2.3 项下方法制备供试品溶液6 份，精密吸取10 μL，并按照2.2.1 项下色谱条件进行检测，绿原酸、龙胆苦苷、络石苷3 种成分含量的RSD 分别为0.87%、1.79%、0.92%，均小于3%，表明此方法的重复性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 取同一批已测定各成分含量的清热除湿止痛液提取液6 份，每份精密称定5 mL，分别加入已知含量的对照品溶液，按2.2.3项下方法制备供试品溶液。再按2.2.1 项下色谱条件进行检测，所得结果为绿原酸、龙胆苦苷、络石苷的平均回收率分别为97.61%、101.40%、98.25%，RSD 分别为0.12%、0.02%、0.05%，加样回收率符合要求。

2.3 干膏得率的测定

精密量取2.1 项下浓缩液5 mL，置已干燥至质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，按照《中国药典》2020 年版（四部）通则0831 测定，按公式（1）计算干膏得率。

2.4 星点设计-响应面试验

2.4.1 熵权法计算权重 信息熵法是将每个评价指标作为1 个随机变量，计算该指标的熵权系数，其取值变异程度越大、越无序，提供的信息量越多，该指标就越重要；反之，该指标就越不重要[4-9]。用熵权法确定权重的计算步骤如下。

1）原始数据矩阵归一化，建立原始评价指标矩阵。设m个评价指标，n个评价对象的原始数据矩阵为A=（aij）mn，对其归一化后得到R=（Xij）mn，对大者为优的指标而言，按照公式（2）归一化。

式中，Xij表示i次试验时第j个评价指标的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

2）将原始数据阵（Xij）mn转换为概率矩阵（Pij）mn；在信息熵公式中Pi为某个信息的概率，满足0≤Pi≤1，必须先对矩阵（Xij）mn做归一化处理，经处理后的矩阵可视为指标的概率矩阵。其中Pij表示第j次试验在第i个评价指标下的概率。

3）计算指标的熵值，确定第i个评价指标的信息熵（Hi）。

4）计算指标的熵权系数（Wj）。

由公式（5）可知，当信息熵值越小，熵权系数越大，即当Xij值相差越大，表明该指标传递的信息量越多，作用越大，其权重值越大。结果见表2。

表2 清热除湿止痛液中3个指标成分及干膏得率权重系数

2.4.2 AHP 法计算权重 AHP 法又名层次分析法，是主观确定权重的方法。依据经验判断并比较各指标的先后顺序，进而构造判断矩阵，建立层次结构模型，再用软件计算各指标权重[10-14]。根据提取液中各指标成分的含量，本实验将绿原酸、龙胆苦苷、络石苷及干膏得率的优先顺序作为权重指标予以量化，构建成对比较的判断优先矩阵。各指标的优先顺序为龙胆苦苷＞绿原酸＞络石苷＞干膏得率，并赋予各项指标相对评分。各项指标经层次分析后得到的权重系数结果见表3。

表3 清热除湿止痛液中3个指标成分及干膏得率成对比较的判断优先矩阵

根据测定结果，运用yaahp 软件处理得到龙胆苦苷含量、绿原酸含量、络石苷含量、干膏得率4项指标权重系数分别为0.585 2、0.225 8、0.110 6、0.078 4，根据公式CR=CI/RI（RI：随机一致性指标），CR=0.059 2＜0.1，即指标优先比较判断矩阵具有良好的一致性，权重系数有效。

2.4.3 AHP-熵权法计算复合权重 通过熵权法和AHP法[17-19]分别计算得到绿原酸、龙胆苦苷、络石苷及干膏得率的复合权重，按公式（6）计算4种指标的复合权重（ωj）分别为0.16、0.76、0.05、0.03。

2.5 星点设计-效应面法优选清热除湿止痛液提取工艺

2.5.1 星点-效应面设计方案及结果 对提取时间（A）、加水量（B）、浸泡时间（C）及提取次数进行单因素试验考察，确定提取数为3 次，其次结合相关文献报道[15-22]，确定提取时间30～150 min，加水量4～12 倍，浸泡时间15～60 min。分别按处方量称取中药65 g，置于圆底烧瓶中，量取适量蒸馏水进行浸泡，按表4中参数进行提取。按2.2.1项下色谱条件测定3 种成分的含量，按公式（7）计算4 种指标质量分数综合评分值（Yj），即因变量。试验设计及结果见表4。

表4 清热除湿止痛液提取工艺星点设计-效应面法试验方案及结果

2.5.2 数据处理与分析 运用Design-Expert 8.0.6.1软件对表4中的数据进行2次多元回归拟合分析（表5），得到提取时间、加水量、浸泡时间与综合评分之间的2 次多元回归模型方程：Y=85.98-2.83A+4.50B-4.63C+0.57AB+4.63AC+1.96BC-7.99A2-1.83B2-4.22C2。由方差分析可知，以综合评分为响应值时P＜0.05，表明此回归方程显著，而失拟项P=0.327 5，不显著，表示未知因素对实验干扰性小。由F值大小看出，各因素对提取工艺影响的主次顺序为C＞B＞A。利用Design-Expert 8.0.6.1 软件得到二次回归方程等高线及响应曲面图，评价试验因素之间的交互强度，来确定最佳提取工艺参数。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，越趋向椭圆表示交互作用越强，越趋向圆形则交互作用越弱，结果见图2。根据模型拟合结果，预测最优提取工艺为提取105 min，浸泡52.5 min，加水量9倍，综合评分84.10。

图2 各影响因素间的交互作用对清热除湿止痛液提取率的响应面图及等高线图

表5 清热除湿止痛液提取工艺星点设计-效应面法试验回归模型方差分析结果

2.6 提取工艺验证实验

根据软件拟合的最优提取工艺条件进行验证实验，按处方量称取中药65 g，平行3 份，置于圆底烧瓶中，按优选的最优工艺参数进行提取，考虑到实际操作情况，将预测的最优工艺参数微调为煎煮105 min，浸泡53 min，加9 倍量的水下于回流提取装置中提取，结果见表6。验证值与预测值之间的RSD 为1.33%，模型预测性好，说明星点设计-效应面法适用于清热除湿止痛液的提取工艺优化，其建立的提取工艺稳定、重复性较好、可操作性强，具一定的实际应用价值。

表6 清热除湿止痛液的提取工艺验证实验结果

3 讨论

3.1 溶剂的选择

因提取液中龙胆苦苷含量较高，绿原酸及络石苷含量较低，故为了使其平衡，采用70%乙醇、无水乙醇溶解样品，发现含乙醇样品色谱图杂质较多；经正丁醇萃取结果发现，绿原酸的含量并未因富集而大幅增加，龙胆苦苷及络石苷的含量变化不明显；加少量酸溶液龙胆苦苷溶解效果也一般。最终经比较选择用甲醇超声溶解处理的样品，较其他方法绿原酸、龙胆苦苷及络石苷各指标成分含量均较高，色谱图峰形好且分离度较佳。

3.2 检测波长的选择

经全波长扫描，分别比较254、270、300、320 nm等波长下色谱图，发现在254 nm 附近龙胆苦苷吸收较好，络石苷峰太低，在320 nm 附近绿原酸吸收较好，龙胆苦苷色谱峰吸收不明显，最终选择280 nm。

3.3 流动相选择

实验过程中分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等流动相进行洗脱，发现色谱峰出现分离不好、拖尾等现象，经比较发现以乙腈-0.25%磷酸水溶液梯度洗脱，色谱峰较好。