陈炳蔚，李勇，王蓉，丁万隆

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京100193

灰葡萄孢Botrytis cinereaPers 为核盘菌科（Sclerotiniaceae）葡萄孢盘菌属（Botrytis）病原真菌，其适应性强、寄主范围广，能侵染草莓、葡萄、番茄等1000 余种植物[1-2]，引起猝倒、烂叶、烂果、花腐等症状。1984 年，由灰葡萄孢引起的人参灰霉病在我国浑北河口参场被首次发现。此后，我国及韩国人参主产区相继发现人参灰霉病[3-5]。近年，灰霉病在我国人参主产区流行成灾，造成人参茎叶腐烂及果实脱落，对整个人参产业影响较大[6]。

目前，灰霉病主要依赖化学防治，常用杀菌剂包括苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、苯氨基嘧啶类等[7]。由于长期频繁使用，灰霉病菌已对上述杀菌剂产生了不同程度的抗药性[8-10]。迄今，人参灰霉病菌抗药性研究鲜有报道。Kim 等[11]发现韩国人参灰霉病对多菌灵的抗性频率高达96.6%；Lu等[12]研究发现，吉林抚松人参灰霉病菌对多菌灵、嘧霉胺和异菌脲的抗性频率分别达到81.6%、46.1%和31.6%。

近年来，我国人参主产区灰霉病呈现高发成灾态势。然而，由于缺乏对我国人参主产区灰霉病菌抗药性的整体了解，人参灰霉病防治存在较大的盲目性。大量“无效”化学农药的使用不仅无助于灰霉病防治，还会造成严重的环境污染，加剧人参农药残留。为此，在课题组前期完成我国人参主产区灰霉病菌采集及分离基础上，本研究对上述灰霉病菌开展室内抗药性实验，进一步明确我国人参灰霉病菌整体抗药性水平、抗药性菌株组成及地域分布特征，为制定科学高效的人参灰霉病害防控策略、有效减轻人参产区生态环境污染及人参农药残留、遏制高抗药性灰霉菌株产生风险提供重要参考。

1 材料

1.1 菌株

供试102 株人参灰霉病菌于2018 年从人参主产区的人参灰霉病叶上分离获得。其中，黑龙江、吉林和辽宁人参灰霉病菌分别为36、45、21株[13]。

1.2 仪器

SPX-15C 型生化培养箱（中仪国科科技有限公司）；BSC-1100ⅡA2 型生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；ME204 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LX-B35L 型蒸汽灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）。

1.3 试药

多菌灵（批号：RNA391，纯度≥98%）、异菌脲（批号：ATZ378，纯度：96%）、嘧霉胺（批号：AZSZ794，纯度：98%）均购于上海毕得医药科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar medium，PDA）培养基（批号：20200310，北京奥博星生物技术有限公司）；七水硫酸镁（批号：1907061，纯度≥99%）、磷酸氢二钾（批号：1905061，纯度≥99%）、氯化钾（批号：1908061，分析纯）、七水硫酸亚铁（批号：1903061，纯度≥99%）均购于西陇科学股份有限公司；L-天冬酰胺（L-asparagine agar medium，ASP，批号：20190325，纯度≥99%）、葡萄糖（批号：20200828，纯度≥99.5%）、琼脂粉（批号：20200604）均购于北京百瑞极生物科技有限公司；丙酮（批号：20200708）、盐酸（批号：20200614）均购于北京市通广精细化工公司；水为蒸馏水。

2 方法

2.1 杀菌剂母液制备

取多菌灵2.5 g，逐滴加入10 mol·L-1盐酸，全部溶解后置50 mL 量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，配制成50 mg·mL-1的多菌灵母液。取异菌脲1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，摇匀溶解后配制成30 mg·mL-1的异菌脲母液。取嘧霉胺1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，摇匀溶解后配制成30 mg·mL-1的嘧霉胺母液。

2.2 含药培养基制备

取PDA 培养基干粉37 g，加蒸馏水定容至1000 mL，高温灭菌，作为PDA 培养基备用。

取七水硫酸镁1 g、磷酸氢二钾1 g、氯化钾0.5 g、七水硫酸亚铁0.01 g、ASP 2 g、葡萄糖22 g、琼脂粉15 g，加蒸馏水定容至1000 mL，高温灭菌，作为ASP 培养基备用。

参考文献[14-16]方法，将母液按比例加入培养基中制成含药平板。平板中杀菌剂质量浓度根据前期预实验结果调整（表1）。

表1 培养基及杀菌剂质量浓度

2.3 杀菌剂对灰霉病菌的半数有效浓度（median effective concentration，EC50）检测及抗药性水平评价

采用菌丝生长速率法测定人参灰霉病菌对3 种化学杀菌剂的敏感性。在生物安全柜中从预先培养好的灰霉菌菌落上取直径5 mm菌饼，接种于含药平板中央，以不含杀菌剂的平板作为空白对照。每个处理3 次重复。接种好的平板置于生化培养箱中25 ℃黑暗培养3 d 后测量菌落直径，按公式（1）计算菌丝生长抑制率。

将生长抑制率转换成几率值（Y）、药剂质量浓度转换成以10 为底的对数值（X），求毒力回归方程Y=aX+b 和r，计算出杀菌剂对供试菌株菌丝生长的EC50[14]。人参灰霉菌对多菌灵、异菌脲和嘧霉胺的抗性水平按参考文献[15,17-18]，并适当调整（表2）。

表2 人参灰霉病菌抗性鉴别标准μg·mL-1

2.4 数据分析

数据处理系统DPS 9.01 用于杀菌剂对人参灰霉病菌菌丝生长的抑制率分析；SPSS 20.0用于判断不同地区间EC50的差异是否有统计学意义。

3 结果

3.1 人参灰霉病菌对多菌灵的抗性水平

由表3可知，供试102株人参灰霉病菌均对多菌灵表现高抗药性（EC50＞640 μg·mL-1），不同产区人参灰霉病菌对多菌灵的抗药性差异无统计学意义。多菌灵在640 μg·mL-1时对人参灰霉病菌的抑制率为0～41.86%，平均抑制率为14.99%。辽宁本溪人参灰霉病菌对多菌灵最敏感，抑制率为41.86%；黑河、靖宇、通化人参灰霉病菌在该质量浓度含药平板上生长正常，与空白对照组差异无统计学意义。

表3 多菌灵对人参灰霉病菌生长的抑制情况

3.2 灰霉病菌对异菌脲的抗性水平

根据异菌脲抗性将供试人参灰霉病分为敏感、低抗、中抗3个等级（表4）。异菌脲对人参灰霉病菌EC50为0.16～5.43 μg·mL-1，均值为（2.37±0.11）μg·mL-1。其中，敏感菌株24 株（23.53%）、低抗菌株16 株（15.69%）、中抗菌株62 株（60.78 %）。黑龙江、吉林、辽宁敏感菌株分别占33.33%、20%、14.29%，EC50均值分别为（2.12±0.18）、（2.42±0.17）、（2.71±0.25）μg·mL-1。黑龙江逊克人参灰霉病菌对异菌脲的抗药性最强，与其他人参产区灰霉病菌对异菌脲抗性的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 人参灰霉病菌对异菌脲的抗性情况

3.3 人参灰霉病菌对嘧霉胺的抗性水平

根据嘧霉胺抗性将供试人参灰霉病菌分为敏感、中抗、高抗3 个等级（表5）。嘧霉胺对人参灰霉病菌的EC50为0.04～78.30 μg·mL-1，均值为（18.42±1.94）μg·mL-1。其中，高抗菌株71株（69.61%）、敏感菌株28 株（27.45%），中抗菌株3 株（2.94%）。嘧霉胺对黑龙江、吉林、辽宁人参灰霉病菌的EC50均值分别为（11.34±2.49）、（23.96±3.28）、（18.69±3.96）μg·mL-1，敏感菌株分别占58.33%、6.67%、19.05%。黑龙江伊春人参灰霉病菌对嘧霉胺最敏感；吉林靖宇人参灰霉病菌对嘧霉胺抗性最强。

表5 人参灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

4 讨论

灰霉病菌具有繁殖快、遗传变异大、适合度高等特点，极易对杀菌剂产生抗药性[19]。自20 世纪70 年代，苯并咪唑类、二甲亚酰胺类、苯氨基嘧啶类等杀菌剂先后引入我国，用于灰霉病防治。但是，不同农作物上的灰霉菌很快对上述杀菌剂产生了抗药性，导致病害田间防效下降甚至完全丧失[18]。

多菌灵、苯菌灵等苯并咪唑类化合物是最早用于灰霉病防治的一类内吸性化学杀菌剂。目前，国内外多种农作物上的灰霉病菌已对该类杀菌剂产生了较强的抗药性[7]。本研究检测发现，课题组2018 年从我国人参主产区分离的102 株人参灰霉病菌均对多菌灵表现极强的抗药性，说明多菌灵在人参灰霉病防治上已经失去应用价值，建议在人参生产上停止使用多菌灵防治灰霉病。

二甲酰亚胺类杀菌剂是20 世纪70 年代继苯并咪唑类杀菌剂之后开发的一类广谱杀菌剂，包括异菌脲、腐霉利等。目前生产上也已出现异菌脲、腐霉利抗性灰霉菌株[20]。研究发现，农作物灰霉病菌对异菌脲的抗性频率呈逐年升高的趋势[9]。本研究发现，我国人参主产区灰霉病菌未产生异菌脲高抗菌株，而中低水平抗性菌株的EC50也较低，说明异菌脲田间抗性风险较低。因此，在人参灰霉病防治上，应结合当地灰霉菌株抗药性水平制定科学合理的防控方案。在异菌脲抗性水平相对较高的地区（如逊克、长白、集安、本溪等地），建议限制异菌脲的使用；而在其他异菌脲相对敏感的人参产区，该杀菌剂可以继续使用，但应加强灰霉病菌对异菌脲的抗药性监测。

苯氨基嘧啶类化合物是20 世纪90 年代研发的专门用于灰霉病防治的化学杀菌剂，嘧霉胺、嘧菌胺和嘧菌环胺等属于该类产品。近年研究发现，我国灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性愈来愈强[18,21]。本研究发现，供试102 株人参灰霉病菌中嘧霉胺抗性菌株约占70%，且绝大部分为高抗菌株，这与国内同类报道结果基本一致[10]。此外，不同省份人参灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性存在很大差异。吉林人参产区嘧霉胺高抗菌株已成为人参灰霉病菌中的优势种群，建议吉林省停止将嘧霉胺用于人参灰霉病防治；而黑龙江伊春、辽宁丹东等人参主产区仍以嘧霉胺敏感菌株为主，建议将嘧霉胺与其他灰霉病杀菌剂混合使用，同时密切关注嘧霉胺抗性菌株动态变化，以延缓嘧霉胺高抗药性菌株的产生。