徐登峰 张邑帆 杨柳 朱买勋

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

生猪养殖是我国畜禽养殖的重要组成部分，由于省区养殖区域分布广泛，猪粪的产量较大，传统的处理方式主要是通过猪粪堆肥进行发酵，处理的时间较长，资源化利用低，猪粪的生产速度远远大于处理的速度。同时猪粪中含有大量的营养物质，如果不能够被及时利用和快速降解，就会污染环境、产生臭气，造成严重的环境污染，也严重限制了养殖业的健康可持续发展[1-3]。猪粪的处理有多种方式，其中生物降解因操作简单、无二次污染、所需设备要求低而倍受关注。由于生物降解的主体是微生物，如何筛选到高效降解粪便的微生物成为本研究的关键[4]。尽管，在自然环境中的微生物，绝大多数是非培养的，可培养的只有少部分。但可培养微生物对促进粪便的快速腐熟和稳定、促进环境改善起到十分重要的作用。培养基对微生物的筛选、分离起到十分关键的作用，合适的培养基可以加快微生物的筛选进程。本研究根据猪粪中营养物质的特点，设计了细菌耐高温和降解能力试验，进行微生物的筛选分离。分离纯化得到猪粪快速降解微生物，为后续的研究工作奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 粪污来源

粪污采集于重庆市畜牧科学院种猪场，采集粪污处于堆肥10d、15d、20d，分别采集粪堆4个角落的高、中、低3个层面的样品，每个粪堆采集的粪样充分混匀为1个样品，共采集样品16个。

1.1.2 主要试剂

水解蛋白质培养基(明胶培养基)，水解脂肪培养基，水解淀粉培养基，纤维素刚果红培养基，营养肉汤培养基，营养琼脂培养基，均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；福尔马林，刚果红染料，卢哥氏碘液等试剂均购于北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

SWCJ1D2D超净工作台购于苏州净化设备有限公司；YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌锅购于上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HN-25S恒温培养箱购于青岛聚创环保集团有限公司；CX31正置显微镜购于奥林巴斯工业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物的分离

准确称取样品10g，放入装有90mL的灭菌生理盐水，并放有玻璃珠的250mL玻璃杯中，浸泡10min后，置于震荡器上振动20min。使微生物分散，静止20～30s，即得到10-1的稀释度。采用逐步稀释法：即再用1mL无菌吸管，吸取10-1的稀释度的溶液2mL移入装有18mL灭菌生理盐水的试管中，吹吸3次以上，让菌液混合均匀，即得到10-2的稀释度；依次类推，连续稀释，制得10-3、10-4、10-5、10-6一系列稀释度菌液。分别接种在营养琼脂平板上，从平板上选择生长较好的，具有代表性的单菌落，划线接种相应的培养基，进行再次纯化。同时，微生物制片，用显微镜作纯度的检查，如果细菌大小一致，均匀分布，则表明菌种纯度好。若菌种不纯，应进一步划线分离，直到获得纯培养物。

1.2.2 耐高温细菌的筛选

参照文亚雄等[5]的文章，普通细菌可分为中温型和高温型，分别将32株纯化好的细菌接种于培养基上，置于30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培养3d，观察细菌的生长情况，判定细菌的耐高温情况。

1.2.3 淀粉降解试验

参照张锋等[6]的文章，将能够耐受高温的细菌接种在淀粉降解培养基上，分别标记为H1～H12，接种的时候划“+”，划线长短为1cm，置于合适的温度下在培养箱中培养至菌落丰厚，加入卢哥氏碘液，均匀地覆盖到培养基上，若菌落周围出现无色透明环圈或者由于碘试剂颜色使培养基轻度发黄者，说明淀粉已经被水解。定量比较筛选细菌水解能力的大小，按以下公式进行计算：

Up=(D/d)2

式中，D为透明环的平均直径，cm，平均直径(cm)=(纵向直径+横向直径)/2；d为菌落大小的平均直径，cm。

1.2.4 明胶液化试验

参照桂文龙等[7]的文章，将待测细菌菌株划“+”线接种在平板上，在19℃的温度下培养至菌落生长丰厚后取出。观察前将包含菌种的平皿于4℃的条件下放置20～30min。若明胶为固体形态即为不液化，记为“-”;若明胶呈液体状即为液化，并且肉眼可见记为“+”，其强弱可用“+、++、+++、++++”表示。

1.2.5 纤维素降解试验

参照张喜庆等[8]的文章，将纯化的细菌接种于纤维素降解培养基上，待细菌长满，加入适量刚果红使用液，染色1h，弃去染液，加入适量1mol·L-1的NaCl溶液，洗涤30min，测量透明圈和菌落的大小，根据菌落周围出现透明圈的大小，筛选微生物分解纤维素能力的强弱。按以下公式进行计算，方法与淀粉降解菌能力统计方法相同。

Up=(D/d)2

2 试验结果

2.1 细菌分离鉴定结果

根据分离得到细菌进行纯化后，比较菌落形态、大小、颜色等指标，结合显微镜下观察结果，筛选到32株不同菌落形态的细菌。分别进行了耐高温培养，发现有30株细菌可以在30℃的温度下进行生长，而35℃、40℃、45℃、50℃的温度下细菌的生长株数分别是31株、29株、16株、12株，呈现出明显的降低趋势，在粪污堆积的过程中会逐渐升温，伴随温度的升高，也有部分细菌会被高温杀死，要实现粪污的快速发酵功能，细菌必须能够持续耐受高温。

表1 不同温度培养环境下细菌的生长情况

2.2 细菌对淀粉降解能力测定试验

由表2可知，有7株细菌出现了明显的晕环现象，其中H5、H8、H9、H10、H12共5株细菌Up值较高，尤其是H8细菌的Up值达到了7.11，说明水解淀粉的能力较强。

表2 细菌对淀粉降解能力测定结果

2.3 细菌液化明胶能力测定试验

由表3可知，在12株细菌中，有10株细菌对明胶有液化作用，将生长平板放置到4℃条件下，根据菌落周围有没有出现明胶重凝固确定降解菌的强弱，其降解能力为H8>H5≥H10≥H2>H12≥H3≥H9>H6≥H7≥H1，尤其是H8株，液化效果达到++++。

表3 细菌对明胶液化能力测定结果

2.4 细菌对纤维素降解能力测定试验

由表4可知，经刚果红筛选平板培养基培养之后，12株细菌均具有降解纤维素的能力，H2、H3、H5、H8、H10降解能力较为明显，Up值均超过10，尤其是H8的Up值最高，达到了23.52，表现出较好的降解纤维素效果。

表4 细菌对纤维素降解能力测定结果

3 分析讨论

在猪粪堆积发酵的过程中，长期的堆积会形成不同的产热层，高温层的位置和厚度随着堆肥发酵时期呈动态变化，其中高温有助于猪粪的发酵腐熟[9]。由于当前生猪养殖使用了大量的精饲料，导致粪便中有大量的蛋白质和淀粉，因此要高效降解猪粪，首先要降解蛋白质和淀粉。除此之外，养殖中产生的猪粪含有大量的水分，密度较高，粪堆中氧气含量不足，不能直接堆肥，需要滤干水分，添加大量的木屑、秸秆等纤维素物质，为了实现猪粪的快速发酵，发酵微生物还需要能够降解纤维素，这样才能将粪便中的有机物转化成腐殖质和有机残渣[10]。试验中分离的32株细菌中有12株能够耐受高温，通过淀粉水解试验、明胶液化试验、纤维素降解试验，兼顾对各成分降解的平衡性，这12株细菌中只有H8株细菌能够符合要求。说明该细菌具有应用于猪粪堆肥快速腐熟，扩大实际生产应用的潜力。