徐颢铭，宋国栋，刘素美，梁生康，张桂玲

( 1. 中国海洋大学 深海圈层与地球系统前沿科学中心/海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室, 山东 青岛 266100；2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237；3. 中国海洋大学 化学化工学 院, 山东 青岛 266100)

1 引言

沉积物中的异化硝酸盐还原过程是氮元素从海洋环境中移除和转化的主要途径之一，主要包括反硝化（Denitrification）、厌氧铵氧化（Anammox）和异化硝酸盐还原为铵（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium, DNRA）3种过程。不同于执行氮气移除的反硝化和厌氧铵氧化，DNRA过程直接将硝酸盐还原为铵，而不是以氮气的形式移除[1-2]，氮元素将继续以化合态的形式存在于海洋环境中，有可能进一步加重富营养化和缺氧等环境问题[3]。近年来对于海洋沉积物中DNRA过程的关注呈现显著上升的趋势[2,4-6]。因而有必要准确评估DNRA速率，从而更准确地评估海洋中氮的收支情况。

由于OX-MIMS法存在上述的系列问题，我们尝试开发一种不以30N在上述的系列为最终分析物的测试方法。Zhang2等[10]的方法将氧化为，而氨基磺酸恰好可以快速地将还原为29N2[19-20]— 一种非常适合MIMS的分析物。因此，本研究探索了一种次溴酸钠氧化-氨基磺酸还原的测定沉积物15N加富样品中的方法（简记为Redox-MIMS法）并应用于莱州湾沉积物样品的DNRA潜在速率测定，为的分析方法提供了一种新的选择。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

15N同位素标记样品中15N2和的测定采用自组装MIMS，仪器具体结构可参考本课题组前期发表的成果[16]；、、等营养盐的测定使用AA3营养盐自动分析仪。

实验试剂包括经过Elix高纯水系统处理的高纯水、(15NH4)2SO4、氨基磺酸、NaOH、KBrO3、KBr、KI、浓盐酸（36%）、Br2，上述试剂均为分析纯。实验所用陈化海水于2016年采自南海海域，经过孔径为0.4 μm醋酸纤维滤膜过滤后避光陈化待用（的本底小于0.2 μmol/L），主要用于本实验中标准溶液配制。

NaBrO-I2氧化剂：NaBrO-I2氧化剂的配制方法参考文献[6，18]。

NaBrO氧化剂：NaBrO氧化剂的配制方法参考文献[10]。该试剂需要临用前配制。

氨基磺酸还原剂：称取0.776 7 g氨基磺酸，溶于100 mL 1∶1 HCl溶液中，得到氨基磺酸还原剂（浓度为80 mmol/L）。

2.2 实验方法

2.2.1 Redox-MIMS法的操作流程

Redox-MIMS法的操作流程如图1b所示：首先在6 mL Exetainer瓶中加入1 mL样品，加入4 mL高纯水稀释，再加入0.5 mL NaBrO氧化剂，氧化30 min，将氧化为。然后加入0.5 mL氨基磺酸还原剂，将还原为15N2。立即盖紧瓶盖后，用MIMS进行测定。为防止原样品中异化硝酸盐还原过程产生的对测定的高估影响，测定加富样品中的时需要将样品中的扣除，的测定采用氨基磺酸还原法，将还原为15N2后用MIMS 测定[21]。

为与目前常用的OX-MIMS法进行比较，所有的标准溶液和样品同时也采用了OX-MIMS法进行测定。OX-MIMS法的操作流程参考文献[13]的方法，如图1a所示：在6 mL Exetainer瓶中加入1 mL样品，加入4.8 mL高纯水进行稀释后，加入0.2 mL NaBrO-I2氧化剂，直接将15NH4+氧化为15N2。立即盖紧瓶盖后，用MIMS仪进行测定。

图1 OX-MIMS法(a)和Redox-MIMS法(b)的操作流程Fig. 1 Procedures of OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

2.2.2 氨基磺酸还原剂的最佳浓度测试

为确定氨基磺酸还原剂的最佳浓度，本实验中配制了浓度分别为20 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L、90 mmol/L、100 mmol/L的氨基磺酸还原剂，分别用Redox-MIMS法对浓度为0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的标准溶液进行测定，并绘制标准曲线。各标准溶液同时用OX-MIMS法测定并绘制标准曲线以进行比较和计算反应相对回收率。相对回收率的计算为

式中，SRedox表示采用Redox-MIMS法测定的标准曲线的斜率；SOX表示采用OX-MIMS法测定的标准曲线的斜率。

2.2.3 样品的采集、培养以及DNRA潜在速率的计算

为进行实际样品的测试，于2020年8月在莱州湾附近海域的3个站位（H1-7、S5、H2-7）采取沉积物和底层水样品进行15N加富泥浆培养，采样站位如图2所示。沉积物样品用箱式采泥器采集后，取0～5 cm表层沉积物装入密封袋中，立刻放入冰箱冷藏保存，24 h内带回陆地实验室进行实验；底层水样品用Niskin采水器采集并过滤后同样放入冰箱中冷藏保存。

图2 沉积物采样站位Fig. 2 Sediment sampling stations

样品带回实验室后进行厌氧条件下的15N加富泥浆培养。取部分混匀后的沉积物分别加入3个培养袋中，加入氦气除氧后的相同站位的底层水。排净培养袋中的空气后，在常温下进行24 h左右的预培养，除去体系中原有的O2、和。预培养后用注射器分别向3个培养袋中加入3种不同的15N标记物：、、+，使体系中各个标记物浓度最终为100 μmol/L左右。各培养袋在常温下培养8 h，并分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h时取样。取样时首先将培养袋摇匀，用注射器取一定量泥浆样品，一部分直接转入提前加好0.1 mL HgCl2饱和溶液的6 mL Exetainer瓶中，采用MIMS测定15N2[16]；剩余部分转入50 mL离心管中，经过离心后取上清液，用0.2 μm孔径的滤膜过滤后转入另一离心管中冷冻保存，用于后续测定和营养盐，其中分别采用Redox-MIMS和OX-MIMS两种方法进行测定并进行比较。

15N2的浓度计算采用文献[16]的计算方法；15的浓度采用测定出的15N2浓度反算得到。15N2和的产生速率由各自浓度随时间变化曲线的斜率表示。反硝化、厌氧铵氧化和DNRA速率的计算方法采用文献[22]的计算公式。沉积物中的DNRA在所有硝酸盐异化还原过程中所占的比例（xDNRA）公式为

式中，VD代表反硝化速率；VA代表厌氧铵氧化速率；VDNRA代表DNRA速率。本实验中方法线性范围的确定以及两种方法的比较等统计学检验均使用Sigmaplot软件完成。

3 结果与讨论

3.1 氨基磺酸还原剂的最佳浓度

如图3所示，当氨基磺酸的浓度达到80～100 mmol/L时，的相对回收率达到最高，为（93.5±0.8）%。Redox-MIMS法使用的次溴酸钠氧化剂相较于OXMIMS法使用的次溴酸钠-碘是一种比较温和的试剂，氧化效率通常在90%～97%[10,12,23]，与本文中的实验结果吻合。因此，后续实验中使用的氨基磺酸还原剂浓度均为80 mmol/L。

3.2 Redox-MIMS法的检测限、精密度和线性范围

实验同时对3组相同的标准溶液进行测定并绘制标准曲线，检测限采用IUPAC规定的标准方法进行计算，公式为

式中，LOD表示检测限；K为与置信浓度有关的常数（本实验中K为3，置信度为99.6%）；Sb为空白标准偏差；m为标准曲线斜率。以标准曲线斜率的相对标准偏差（RSD）代表方法的精密度。

实验结果表明，Redox-MIMS法的检测限为0.5 μmol/L，精密度为0.8%，在一定程度上本研究建立的Redox-MIMS法略显优势[13]。如图4所示，当标准溶液系列最高浓度超过150 μmol/L时，标准曲线的斜率发生显著性降低（p<0.001），因此该法的线性范围为0～150 μmol/L，这与次溴酸钠氧化剂的氧化能力有关，按照本研究的操作流程，Exetainer瓶内150 μmol/L的标准溶液最终的浓度约为25 μmol/L，这与次溴酸钠氧化剂的氧化能力的上限相吻合[10,23]，可以满足 目前对于沉积物加富样品中测定的要求。

图4 Redox-MIMS法标准曲线的线性范围Fig. 4 Linear range of standard curve using Redox-MIMS method

3.3 Redox-MIMS法与OX-MIMS法的比较

为将Redox-MIMS法与目前广泛使用的OXMIMS法进行比较，将同一组标准溶液采用上述两种方法测定并绘制工作曲线进行比较。实验结果显示，Redox-MIMS法的工作曲线斜率相对较低，约为OXMIMS法的96%，这也与上文所述的实验结果相符，即与次溴酸钠氧化剂的氧化效率有关。

为计算两种方法产生的30N2占15N2的比例，我们分别对使用两种方法测定的标准溶液产生的29N2、30N2和15N2（15N2=29N2+2×30N2）对浓度作图进行比较（图5）。采用OX-MIMS法测定的标准溶液产生的15N2几乎全部为30N2，而采用Redox-MIMS法产生的几乎全部为29N2。这说明Redox-MIMS法能够有效避免产生30N2。另外，在实际测样中29N2相对于30N2能够更快的在检测器中达到平衡，在进样量更少的情况下29N2的曲线也可以出现测定的峰值平台以完成定量分析。因此，采用Redox-MIMS法的测样时间在笔者所用的MIMS上被缩短至2 min/样品（图6），而一般采用MIMS进行29N2和30N2同时测定需要3～5 min的时间，由此可知，Redox-MIMS法进一步提高了测样效率。

图5 OX-MIMS法（a）和Redox-MIMS法（b）测定产生29N2和30N2的比例Fig. 5 Ratios of 29N2 and 30N2 produced using OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

图6 OX-MIMS法（a）和Redox-MIMS法（b）测定的曲线Fig. 6 Detection curve using OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

3.4 莱州湾沉积物的DNRA速率测定

莱州湾3个站位的沉积物中15N加富培养实验结果如图7所示。对于加富的实验组，15N2并没有显著增加（图7b1至图7b3，p>0.05），说明预培养已经将大部分的O2和去除；对于加富+的实验组，样品培养过程中29N2随时间显著增加（图7c1至图7c3，p<0.05），说明各站位的沉积物中均发生厌氧铵氧化过程；对于加富的实验组，样品培养过程中30N2和均随时间显著增加（图7a1至图7a3和图7d1至图7d3，p<0.05），说明各站位沉积物中均存在反硝化和DNRA过程。进一步采用文献[22]的方法计算3种异化硝酸盐还原速率（以N计）。结果表明（图8），莱州湾3个站位的沉积物中的异化硝酸盐还原过程均以反硝化为主，占比为88.5%～90.2%；其次为DNRA，占比为7.0%～9.5%；厌氧铵氧化占比最低，为0.4%～2.8%。

图7 莱州湾H1-7、S5、H2-7站位沉积物不同15N加富培养体系中15N2和浓度随时间变化Fig. 7 15N2 and concentration production with time changes in different 15N tracer enrichment incubation systems of sediments in stations H1-7, S5, H2-7 in the Laizhou Bay

图8 各站位异化硝酸盐还原速率占比情况Fig. 8 Proportion of each dissimilatory nitrate reduction process in different stations

采用Redox-MIMS法和OX-MIMS法两种方法测得的DNRA速率（以N计）以及DNRA占异化硝酸盐还原的比例（xDNRA）并无显著性差异（图9，p>0.05）。说明Redox-MIMS法在对OX-MIMS进行优化的基础上，同样适用于15N加富沉积物泥浆培养样品中的的测定。

图9 采用两种方法测定的DNRA潜在速率以及xDNRA值Fig. 9 Determination results of DNRA potential rates and xDNRA using two different methods

4 结论

本研究探索建立了一种次溴酸钠氧化-氨基磺酸还原测定沉积物15N加富样品中的新方法（Redox-MIMS法）。方法检测限为0.5 μmol/L，精密度为0.8%，线性范围为0～150 μmol/L。相对于目前广泛使用的OX-MIMS法，Redox-MIMS法反应条件更加温和，试剂相对易得，并且产生的15N2绝大部分为29N2，有效避免了30N2带来的受O2影响、在检测器中平衡较慢且测试波动较大的一系列问题，同时进一步显著提升了测定效率（2 min/样品），且具有样品消耗少（1 mL）、操作简单等优点。本研究同时对莱州湾3个站位的沉积物样品进行了15N加富培养，证实莱州湾沉积物中同时存在反硝化、厌氧铵氧化以及DNRA 3种异化硝酸盐还原过程，并且以反硝化过程为主导，DNRA次之，厌氧铵氧化最弱。通过两种不同方法测定并计算DNRA速率的对照实验结果表明，采用Redox-MIMS法测定的DNRA潜在速率与采用OX-MIMS法测定的结果并无显著性差异，说明Redox-MIMS法同样适用于15N加富沉积物泥浆培养样品中的的测定，有望未来在沉积物氮循环领域得到广泛应用。

致谢：感谢海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室张国玲实验师在营养盐自动分析仪的使用方面提供的指导。感谢许泽浩同学在样品采集方面提供的帮助。感谢实验室罗畅同学在实验操作以及MIMS仪器使用方面的帮助和指导。