梁国新，梁茵茹，刘淑贤，陈康振，林 勇，秦江霞*，吴洪福*

(1.广东医科大学附属第三医院(顺德龙江医院)， 广东 佛山 528318； 2.广东医科大学附属广州花都医院，广东 广州 510800； 3.广东医科大学 干细胞与再生组织工程重点实验室， 广东 东莞 523808)

神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是细胞移植常用的种子细胞[1]，但直接移植NSCs至损伤局部难以维持其良好的增殖状态，且不利于移植NSCs进行增殖分化[2]。Pluronic F-127(PF-127)是一种温敏性水凝胶，可作为NSCs体外扩增和移植的支架材料[3]。富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo 受体相互作用蛋白1[leucine-rich repeat(LRR) and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein 1,LINGO-1]是中枢神经损伤后抑制轴突再生和神经元分化的重要负性调控因子[4]，通过基因敲除工具短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)抑制NSCs LINGO-1基因的表达。此外，NSCs的增殖和分化还受到多种神经营养因子的影响，它们促进其增殖、分化和存活[7-8]。基于此，本研究拟用PF-127水凝胶负载编码LINGO-1 shRNA慢病毒(lenctiviral,LV))及神经营养因子混合物(neurotrophic factors,NTFs)(PF-127-LV-NTFs)以构建复合支架，体外三维培养SD大鼠乳鼠大脑皮质脑组织来源NSCs，并观察该复合支架对NSCs存活、增殖及分化的影响，评估该复合支架三维培养是否有利于NSCs的增殖和定向分化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级0～3 d龄SD大鼠乳鼠2只，用于NSCs的提取[南方医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(粤)2017-0123]。

1.1.2 试剂：PF-127、多聚甲醛、胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM/F-12、N-2添加剂、B27、青霉素链霉素、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Trizol、GAPDH、化学发光液和山羊抗大鼠Alexa Fluor 488、山羊抗兔Alexa Fluor 568(Thermo Fisher Scientific公司)；表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech公司)；巢蛋白(Nestin)、RIPA裂解液、β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin)(Millipore公司)；PrimeSriptTMRT Master Mix试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；LINGO-1、磷酸二酯酶(CNPcase)(Abcam公司)；HRP羊抗鼠/兔(ABclonal公司)；0.3% Triton X-100(Biomol公司)；……