贺国洋，陈庆庆，邓美静，王高翔，王贝玺，王永霞，李 巍，千新来，朱会芳

1.新乡医学院病理学系，河南 新乡 453003；

2.新乡医学院法医物证教研室，河南 新乡 453003；

3.新乡医学院第三附属医院病理科，河南 新乡 453003；

4.新乡医学院第四临床学院病理科，河南 新乡 453003；

5.新乡医学院第一附属医院结直肠肛门外科，河南 新乡 453003

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一［1］，胃癌早期无特异性症状，80%的患者确诊时已是中晚期［2］，肿瘤转移是导致胃癌患者死亡的主要原因。胃癌的危险因素主要为幽门螺旋杆菌感染［3］。随着传统放疗、化疗和新辅助治疗的进步，早期胃癌患者的5年生存率可达到95%［1］。

Diaphanous相关成蛋白3（diaphanous-related formin 3，DIAPH3）是一种肌动蛋白结合蛋白，由FDD、FH1和FH2结构域组成，位于人类染色体13q21.1上，研究发现DIAPH3在减数分裂、有丝分裂、囊泡运输、细胞内运输等过程中间接影响肌动蛋白和微管网络而发挥重要作用［4］。DIAPH3作为一种非典型的转移调节因子，在肿瘤中可抑制细胞向阿米巴样细胞的转化［4］。据文献报道，DIAPH3通过激活硒蛋白三R1介导的抗氧化作用促进胰腺癌的进展［5］。DIAPH3通过激活β-actin/TCF信号转导通路来促进肝癌细胞的生长、迁移和转移［6］。在肺腺癌中，可以观察到DIAPH3的表达，可能受到P53负调控［7］。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）是一种致癌基因，在多种肿瘤中表达上调，与细胞增殖密切相关［8］。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），在肿瘤转移中发挥重要作用，EMT赋予肿瘤细胞起始和转移的潜能［9］。但DIAPH3在胃癌中的作用及其分子机制未见报道。

本文主要探究DIAPH3对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制，旨在为胃癌患者的诊治寻找新的靶点。

1 材料和方法

1.1 临床资料

62例胃癌患者的石蜡包埋癌组织及配对癌旁组织均来自于2020年1月—2020年12月年新乡医学院第四临床学院病理科保存的石蜡标本。纳入标准：患者术前均未行放疗、化疗及免疫治疗，具有手术治疗适应证，符合胃癌手术病理学诊断标准。本研究获得新乡医学院伦理委员会的批准，所有患者均知情同意。

1.2 细胞培养与主要试剂

胃癌细胞（HGC27、AGS、SGC7901、MKN28）均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胃癌细胞系SGC7901、HGC27在含10%FBS和双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100 µg/mL）的高糖DMEM培养基中培养，AGS在含10%FBS和双抗F12K培养基中培养，MKN28在含10%FBS和双抗RPMI-1640培养基中，放置在CO2体积分数为5%、37 ℃的恒温温育箱中培养。高糖培养基购自美国Hyclone公司，Opti-MEM无血清培养基购自浙江森瑞生物有限公司，胎牛血清FBS购自美国Gibco公司，细胞培养皿、细胞培养板购自美国Thermo公司，RIPA裂解液、Western blot试剂盒上海碧云天生物技术有限公司，脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，TRIzol购自美国Technologies公司，2×SYBR Green PCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，GAPDH（AP0066）抗体购自美国Sigma公司，DIAPH3（14342-1-AP）抗体和cyclin D1（26939-1-AP）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司，E-cadherin（#33541）抗体和vimentin（#38550）抗体购自美国SAB公司，N-cadherin（CY5015）抗体购自郑州白苹生物科技有限公司。过表达质粒由擎科生物科技有限公司设计合成，DIAPH3小干扰片段（siRNA）、干扰对照片段（NC）、cyclin D1小干扰片段（siRNA）和vimentin小干扰片段（siRNA）均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学检测

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结染色法，4%多聚甲醛固定标本，石蜡包埋，切片，脱蜡，水化，PBS清洗。高压修复、室温冷却，PBS清洗，加入3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次。山羊血清封闭3 h，甩干血清后，直接加入DIAPH3特异性抗体（1∶300），于4 ℃冰箱温育过夜。次日，室温下放置1 h。滴加山羊抗兔二抗，37 ℃温育30 min，PBS清洗，DAB显色，苏木精复染、流水蓝化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。①根据阳性细胞比例计算：阳性细胞数≤25%计1分，26%～50%计2分，＞50%计3分。② 根据阳性细胞染色程度计分：未染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分。将两项得分结果相乘：0～3分结果为阴性，4～6分结果为阳性［10］。

1.3.2 细胞转染与分组

转染时取对数生长期的细胞，将细胞接种于6孔板中，待细胞长至70%，根据说明书将2 μg 表达质粒/4 μL RNAi片段分别利用4 μL LipofectamineTM2000转染至细胞中，6～8 h后换无双抗10%FBS培养基，24～48 h后收集细胞做后续实验。将细胞分为干扰对照组（NC组）、干扰DIAPH3组（si-DIAPH3组）、过表达对照组（control组）、过表达DIAPH3组（DIAPH3组）、过表达DIAPH3干扰cyclin D1组（DIAPH3+si-cyclin D1组）和过表达DIAPH3干扰vimentin组（DIAPH3+si-vimentin组）。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测

收集转染细胞利用TRIzol法提取总RNA，用cDNA反转录试剂盒进行反转录，RTFQPCR反应体系为10 μL，包括上下游引物各0.25 μL，cDNA模板为2 μL，双蒸水2.5 μL，SYBR Green染料5 μL。反应条件为：95 ℃10 min；95℃ 15 s；53℃ 45 s，40个循环。β-actin上游引物为5'-CGCGAGATGACCCAGAT-3'，下游引物为5'-TCACCGGATCCATCACGAT-3'；DIAPH3上游引物为5'-TGAATAACTTCAGAA CCACATT-3'，下游引物为5'-CTCCTGTCTC ATCACCCT-3'。干扰NC片段5'-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAA TT-3'，干扰si-1片段5'-GCCUGGAUAUCCAAC UUAATTUUAAGUUGGAUAUCCAGGCTT-3'，干扰si-2片段5'-GCUCAAACCUUCGGAUUUA TTUAAAUCCGAAGGUUUGAGCTT-3'，cyclin D1干扰片段为5'-AAACACGCGCAGACCTTCG TTGCCTTGCACTGCGGCCACC-3'，vimentin干扰片段为5'-ACCAGCTAACCAACGACAAAGC CCGTGCCAGAGACGCATTGTCAACA-3'。根据2-ΔΔCt值计算相对表达量，实验重复3次，计算平均值。

1.3.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测

提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白浓度，取30 μg蛋白用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE）。清洗玻璃板，置于烘箱中烘干备用；检漏后分别配浓缩胶和分离胶，待胶凝固后将玻璃板取出置于电泳槽中，加入电泳液，拔出梳子，加样，80 V展开浓缩胶，120 V展开分离胶；260 mA恒流转至PVDF膜180 min；转膜完毕后，将膜取出，放置于5%牛血清白蛋白中封闭2 h；用镊子将膜取出，分别温育一抗DIAPH3抗体（1∶1000）、cyclin D1抗体（1∶1000）、E-cadherin抗体（1∶1000）、vimentin抗体（1∶1000）、N-cadherin抗体（1∶1000）4 ℃过夜；洗膜缓冲液（trisbuffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次15 min；室温温育二抗（1∶5000）1 h；TBST洗膜3 次，每次15 min；电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）显影。以GAPDH为内参，结果以不同处理组与GAPDH的灰度值比值表示。

1.3.5 CCK-8增殖实验

取转染24 h后的细胞，0.25%胰蛋白酶1 mL消化，以2×103个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔，分别于第1～5天每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃恒温温育箱培育2 h，利用全自动酶标仪检测450 nm处每孔的吸光度（D）值。

1.3.6 细胞划痕愈合实验

将胃癌细胞接种到6孔板中，按上述转染方式进行细胞转染，转染后继续培养24 h后，行划痕操作，并用 PBS 冲洗以去除细胞碎片。在0、24和48 h观察细胞的迁移情况，并拍照记录。

1.3.7 Transwell小室实验

将胃癌细胞接种到6孔板中，按上述转染方式进行细胞转染，转染后继续培养24 h后，消化细胞，计数，用不含血清的培养基稀释至细胞密度为5×105个/mL，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%FBS培养基，37 ℃培养箱继续培养24 h，用移液器吸嘴吸去上室培养液，加入4%的多聚甲醛组织固定液30 min，PBS洗2遍，再加1 mL 0.1%结晶紫染液于24孔板中，放入小室，固定染色30 min；PBS洗净并倒置风干，正置显微镜下观察拍照。每张膜选5个视野，计算平均细胞数。

1.4 统计学处理

实验中所获得的数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料均以表示。图表采用GraphPad Prism 8.2软件绘制。两组间比较采用t检验分析；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DIAPH3在胃癌组织中的表达升高

GEPIA数据库［11］在线分析显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中DIAPH3在mRNA水平显著上调（P＜0.05）。免疫组织化学染色结果显示，DIAPH3主要定位于细胞质中，染色呈强阳性，为棕褐色颗粒；胃癌组织中DIAPH3的阳性率为70.97%（44/62），高于癌旁组织的16.13%（10/62），差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

图1 DIAPH3在胃癌中表达升高Fig.1 Higher expression of DIAPH3 in gastric cancer tissues

2.2 胃癌组织中DIAPH3表达水平与临床病理学特征的相关性

免疫组织化学检测结果表明，与高中分化组相比，低分化组中DIAPH3蛋白质水平显著升高（P＜0.05）；与无淋巴结转移组相比，有淋巴结转移组中DIAPH3蛋白质水平显著升高（P＜0.05）。而DIPAH3蛋白质水平与患者性别、年龄和肿瘤直径无显著相关性（P＞0.05，表1）。

表1 胃癌组织中DIAPH3表达水平与临床病理学特征的关系Tab.1 Relationship between DIAPH3 expression and clinicopathological characteristics in gastric carcinoma

2.3 基因修饰后胃癌细胞中DIAPH3蛋白质和mRNA的表达

Western blot和RTFQ-PCR实验结果显示，在4株胃癌细胞中DIAPH3蛋白质和mRNA的表达由高到低依次为HGC27、AGS、SGC7901和MKN28（图2）。在HGC27和AGS细胞中，转染干扰片段后，si-DIAPH3-1组和si-DIAPH3-2组DIAPH3蛋白质和mRNA表达显著低于干扰对照组（P＜0.05），本研究选取效率最高的干扰片段1进行后续的功能实验。在SGC7901和M KN28 细胞中，转染DIAPH3 质粒后，过表达组中DIAPH3表达量显著高于对照组（P＜0.05，图2）。

图2 DIAPH3在敲低或过表达胃癌细胞中的效率验证Fig.2 Efficiency verification of DIAPH3 in gastric cancer cells after knocking down or over-expressing DIAPH3

2.4 DIAPH3通过增强cyclin D1的表达促进胃癌细胞的增殖

CCK-8实验结果显示，与阴性对照组比较，si-DIAPH3组HGC27和AGS细胞的增殖活力显著下降（P＜0.05)；与对照组相比，DIAPH3过表达组SGC7901和MKN28细胞的增殖活力显著增强（P＜0.05）。Western blot实验结果显示，与阴性对照组比较，si-DIAPH3组HGC27和AGS细胞中cyclin D1蛋白质表达量显著降低（P＜0.05）；Western blot和RTFQ-PCR实验结果显示，与对照组相比，DIAPH3+si-cyclin D1组蛋白质表达量显著增加，与DIAPH3组比较，DIAPH3+si-cyclin D1组蛋白质表达量显著降低（P＜0.05）；CCK-8实验结果显示：与对照组相比，DIAPH3+si-cyclin D1组细胞增殖活力显著增强（P＜0.05），与DIAPH3组相比，DIAPH3+sicyclin D1组细胞增殖活力显著下降（P＜0.05）。本研究结果提示，DIAPH3通过增强cyclin D1表达促进胃癌细胞的增殖（图3）。

图3 DIAPH3通过增强cyclin D1的表达促进胃癌细胞的增殖Fig.3 DIAPH3 promotes the proliferation of gastric cancer cells through enhancing the expression of cyclin D1

2.5 DIAPH3通过EMT促进胃癌细胞的迁移和侵袭

划痕愈合实验和transwell小室实验结果显示，与干扰对照组比较，si-DIAPH3组HGC27和AGS 细胞的迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）；与对照组相比，DIAPH3过表达组SGC7901和MKN28细胞的迁移和侵袭的能力均显著增强（P＜0.05）。EMT是上皮来源的肿瘤细胞获得侵袭转移能力的重要生物学过程，在这一过程中，上皮细胞失去了细胞极性，获得了较高的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力等间质表型。我们进一步通过Western blot实验检测了EMT相关蛋白质的表达，结果显示，与对照组相比，干扰DIAPH3组HGC27和AGS细胞中E-cadherin蛋白质表达显著增高，N-cadherin和vimentin蛋白质表达显著降低（P＜0.05）；与对照组相比，DIAPH3过表达组SGC7901和MKN28细胞中E-cadherin蛋白质表达显著降低，N-cadherin和vimentin蛋白质表达显著增高（P＜0.05）。为了证明DIAPH3通过EMT促进胃癌细胞的迁移和侵袭，我们用SGC7901和MKN28细胞，过表达DIAPH3后干扰vimentin，检测胃癌细胞中vimentin的表达量。Western blot和RTFQ-PCR结果均显示，与对照组相比，DIAPH3+si-vimentin组vimentin转录水平和蛋白质表达量显著增加；与DIAPH3过表达组相比，DIAPH3+si-vimentin组vimentin转录水平和蛋白质表达量显著降低（P＜0.05）。划痕愈合实验和transwell小室实验结果显示，与对照组相比，DIAPH3+si-vimentin组SGC7901和MKN28细胞的迁移和侵袭的能力均显著增强（P＜0.05）；与DIAPH3过表达组相比，SGC7901和MKN28细胞的迁移和侵袭的能力均显著降低（P＜0.05，图4）。

图4 DIAPH3促进胃癌细胞迁移Fig.4 DIAPH3 promotes the migration capacity of gastric cancer cells

图6 DIAPH3促进胃癌细胞EMT进程Fig.6 DIAPH3 promotes EMT progression of gastric cancer

3 讨 论

胃癌是全球第5大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡第3大原因。胃癌的危险因素主要为幽门螺杆菌感染［3］。胃癌的组织分型90%为腺癌［12］，尽管外科手术、放疗、化疗和新辅助治疗技术不断进步，但患者预后仍较差［10］。根据调查分析，年轻人患胃癌的发病率正在逐渐增加［13］。由于早期胃癌诊断率过低，大部分患者一经发现就为中晚期胃癌，从而错过最佳治疗时期。转移是导致胃癌患者死亡的重要原因。因此针对胃癌寻找新的诊疗靶点，是目前研究的重点。

DIAPH3 基因定位于染色体13q 21.2，是diaphanous相关成蛋白［14］家族的一员。Diaphanous相关成蛋白［14］家族成员广泛参与肌动蛋白重塑和调节细胞的运动和黏附，如内吞运输、有丝分裂、细胞极性和迁移等［15］。在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞的形态发生改变是由细胞骨架控制的。另有研究证实DIAPH3在肺癌［17］、前列腺癌和乳腺癌［4］中均发挥重要作用。目前，DIAPH3在胃癌中的作用及其分子机制未见报道。本研究通过GEPIA数据库在线分析和免疫组织化学实验证实胃癌组织中DIAPH3表达显著增高。CCK-8实验结果显示，干扰DIAPH3后胃癌细胞的增殖能力下降，而过表达DIAPH3后胃癌的增殖能力增强。已有研究证实，cyclin D1通过与细胞周期蛋白依赖性激酶结合，使细胞通过G1期进入S期完成分裂增殖，cyclin D1的过度表达缩短了G1期的时限，促使细胞发生恶性增殖，因而cyclin D1的水平变化可用于多种肿瘤诊断及预后判断［16-18］。干扰DIAPH3后胃癌细胞中cyclin D1蛋白质表达下降，过表达DIAPH3后胃癌细胞中cyclin D1蛋白质表达上调。CCK-8实验结果显示，过表达DIAPH3后干扰cyclin D1，胃癌细胞增殖能力较过表达DIAPH3的增殖能力降低。本研究结果提示，DIAPH3通过增强cyclin D1的表达进而促进胃癌细胞的增殖。划痕愈合实验和transwell小室实验结果表明，干扰DIAPH3后，胃癌细胞的迁移和侵袭能力下降，而过表达DIAPH3后，胃癌细胞的迁移和侵袭能力增强。过表达DIAPH3后干扰vimentin，胃癌细胞的迁移和侵袭能力较过表达DIAPH3胃癌细胞的迁移和侵袭能力下降。EMT在肿瘤转移中起着重要作用，是肿瘤细胞发生转移的第一步，在此过程中，肿瘤细胞失去细胞极性，形成具有迁移能力的间质细胞［19-20］。为了明确DIAPH3是否通过EMT进程促进胃癌细胞的迁移和侵袭。Western blot实验结果表明，干扰DIAPH3后，胃癌细胞中E-cadherin蛋白质表达增高，N-cadherin和vimentin蛋白质表达降低，而过表达DIAPH3后，胃癌细胞中E-cadherin蛋白质表达降低，N-cadherin和vimentin蛋白质表达增高。我们的研究结果表明，DIAPH3通过EMT进程促进胃癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，DIAPH3在胃癌中表达增高，且DIAPH3表达与肿瘤分化和有无淋巴结转移密切相关，DIAPH3通过增强cyclin D1的表达进而促进胃癌细胞的增殖。DIAPH3通过EMT进程促进胃癌细胞的迁移和侵袭。