罗云龙 陈淑怡 王洋 白东清

摘要：本研究选用重要的水产革兰氏阴性病原菌——嗜水气单胞菌ATCC35654、CICC10500与副溶血弧菌ATCC17802为指示菌，利用比浊法进行试验，以OD600值为判断标准，筛选出抑菌能力较强的Pardaxin-4作为抑菌剂，探讨其与乳酸共同抑菌作用的量效关系。结果发现：低浓度的Pardaxin-4可以协同乳酸抑制嗜水气单胞菌CICC10500的生长。当Pardaxin-4浓度为30 μmol/L、乳酸浓度为5.5 mmol/L时对指示菌能产生相加抑菌作用，12 h致死率达到88%。研究结果可为鱼源抗菌肽和乳酸在水产养殖中对抗革兰氏阴性病原菌的应用以及水产品的保鲜提供理论依据。

关键词：乳酸;抗菌肽;共同抑制;水产养殖

抗菌肽是一类由生物细胞特定基因编码产生的小分子肽，具有高效的抑菌活性和较高的稳定性[1]。然而，革兰氏阴性菌外膜（OM）作为细菌的渗透屏障，具有一定的保护作用，使革兰氏阴性菌对抗菌肽存在天然抗性。研究认为，外膜通透剂乳酸具有增强革兰氏阴性菌外膜通透性的作用[2]。基于此，本试验将乳酸与几种鱼源抗菌肽联合使用，共同处理革兰氏阴性菌，从而筛选出较为有效的抗菌肽与乳酸组合并评估其抑菌效果。本研究能够为水产养殖业中抗菌药物的开发与应用提供新思路，也能够为革兰氏阴性菌疾病的治疗与水产品的保鲜提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1指示菌与抗菌肽

嗜水气单胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802购自中科质检有限公司。鱼源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4（Pard-4）通过固相合成法制备，纯度大于96%。

1.2试验方法

1.2.1抗菌肽筛选

将培养至对数期的嗜水气单胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802菌液接种于LB液体培养基，使活菌数为1×107 CFU/mL，分别加入不同终浓度（10、50 μmol/L）的抗菌肽。采用96孔板法测定菌液的OD600值[3]。

1.2.2乳酸与抗菌肽对革兰氏阴性水产病原菌生长的协同抑制作用

以嗜水气单胞菌ATCC35654、CICC10500为指示菌，测定乳酸与抗菌肽对指示菌的部分最低致死浓度。分别以活菌数为1×107 CFU/mL的菌液作为对照组;以乳酸（终浓度为5.5 mmol/L）处理为乳酸处理组;添加不同浓度抗菌肽（终浓度为20、30、40 μmol/L）为抗菌肽处理组;添加不同浓度的乳酸+抗菌肽为共同处理组。每组设三个平行。于30 ℃培养12 h后测OD600值。

各试验组于4 ℃处理0、4、8、12 h后离心（4 ℃，1600 g），弃上清并用无菌生理盐水重悬。使用平板计数培养基，以倾注法倒平板，于30 ℃培养12 h后通过平板计数法计算菌落数量[4]。

2 结果与分析

2.1 数据分析方法

本研究所有数据均用Excel 2003、ORIGIN 8、SPSS 13.0进行分析处理。利用Excel软件计算得出各组数据的标准偏差;利用ORIGIN 8软件绘图;利用SPSS软件进行方差分析，结果均以平均值±标准差表示，每个指标设置三个重复。

2.2 结果与分析

2.2.1抗菌肽的初步筛选

选用鱼源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4作为抑菌剂，考察其对水产革兰氏阴性病原菌的抑制作用。抗菌肽浓度为10 μmol/L时，与对照组相比，Pardaxin-4单独处理组对指示菌嗜水气单胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802的生长有明显抑制作用，生长抑制率分别为14.4%、9.7%、14.7%;Moronecidin、Misgurin单独处理组对嗜水气单胞菌ATCC35654 、副溶血弧菌ATCC17802的生长有明显抑制作用，对嗜水气单胞菌CICC10500的生长有促进作用。随着浓度增加（50 μmol/L），以上抗菌肽对嗜水气单胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的抑制作用降低，对嗜水气单胞菌CICC10500的抑制作用升高。总体而言，抗菌肽Pardaxin-4对所有指示菌的生长均有抑制作用，抑菌能力较强。

2.2.2 抗菌肽的选定与最小抑制浓度的确定

进一步筛选乳酸与Pardaxin-4协同的适宜浓度范围。对于嗜水气单胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802来说，不同浓度的Pard-4（10、20、30、40 μmol/L）与乳酸（5.5 mmol/L）共同处理对抑菌效果没有明显提升。各浓度Pard-4与乳酸的共同处理组与乳酸单独处理组均降低了指示菌的OD600值，对指示菌有一定的生长抑制作用，但是两组间OD600值没有显著差异，无法排除共同处理组的抑菌作用完全由乳酸造成的可能。

对于嗜水气单胞菌CICC10500，不同浓度Pard-4与乳酸的共同处理组与乳酸单独处理组均降低了指示菌的OD600值，对指示菌有生长抑制作用。其中，Pard-4与乳酸的共同处理组OD600值显著低于乳酸单独处理组，二者对嗜水气单胞菌CICC10500具有协同抑菌效果。在Pard-4与乳酸的共同处理组中，当Pard-4浓度达到30、40 μmol/L时，指示菌的OD600值降至最低且不再随抗菌肽浓度升高而改变。因此，在与5.5 mmol/L乳酸联合使用下，对嗜水气单胞菌CICC10500有协同抑菌效果的Pard-4的最小抑菌浓度为30 μmol/L。

2.2.3乳酸与Pard-4对革兰氏阴性水产病原菌的协同致死浓度

以嗜水气单胞菌CICC10500为指示菌，检测细菌在Pard-4与乳酸协同处理下的活菌数。在Pard-4与乳酸协同处理下，指示菌的活菌数量随处理时间延长而减少。乳酸单独处理12 h对嗜水气单胞菌CICC10500的致死率为72%，Pard-4与乳酸共同处理12 h后嗜水气单胞菌CICC10500的死亡率为88%。

3 讨论

本研究发现Pardaxin-4单独处理时对三种指示菌均有生长抑制作用，这可能是源于它对细菌膜的成孔活性[5]。试验显示，Pardaxin-4浓度升高时对指示菌嗜水气单胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的生长抑制作用减弱，此现象的机理尚未明确;推测该抗菌肽可能是菌体生长的营养物质或影响菌体代谢的信息递质，从而促进细菌生長。单独低浓度乳酸处理对嗜水气单胞菌具有一定的生长抑制作用。当以Pardaxin-4与乳酸共同处理嗜水气单胞菌CICC10500时，菌体的生长进一步受到抑制，致死率显著升高。

参考文献：

[1]唐馨， 毛新芳， 马彬云， et al. 抗菌肽的研究现状和挑战 [J]. 中国生物工程杂志， 2019， v.39;No.329（08）： 92-100.

[2]ALAKOMI H-L， SKYTTA E， SAARELA M， et al. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane [J]. Applied and environmental microbiology， 2000， 66（5）： 2001-5.

[3]马欢欢， 林洋， 吕欣然， et al. 96孔板法筛选抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌机理研究 [J]. 食品工业科技， 2017， 38（012）： 171-5.

[4]丁华， 王建清， 王玉峰， et al. 罗勒精油和Nisin复配抑菌剂抑菌效果的研究 [J]. 中国调味品，

[5]LAZAROVICI P， PRIMOR N， LOEW L M. Purification and pore-forming activity of two hydrophobic polypeptides from the secretion of the Red Sea Moses sole （Pardachirus marmoratus） [J]. Journal of Biological Chemistry， 1986， 261（35）： 16704-13.