秦 露， 韩 蕊， 张 先, 李范洙

(延边大学 农学院，延吉 吉林 133002)

寒葱(AlliumvictorialisL.)是百合科、葱属的多年生草本植物，学名为茖葱，别名山葱、鹿耳葱等。寒葱主要分布于北半球温带，在半荫环境下生长良好，耐寒且遇寒生长更旺盛，味辛辣如葱而得名“寒葱”，有止血、散淤、化痰、止痛的功效。寒葱含有葱香，具有味美、腌制后爽口甘甜的特点，享有“菜中灵芝”的美誉。寒葱营养丰富、风味独特，是一种具有重要生物学功能和营养价值的绿色植物。寒葱中富含维生素 C、氨基酸及有利于人体健康的活性成分，如多酚、黄酮[1]等。

目前国内的寒葱研究大多与其栽培种植[2-5]及成分生物活性[6-9]相关，鲜见关于寒葱蛋白提取及营养评价方面的研究。在前期研究中发现，寒葱与其他植物相比蛋白质含量较高。有研究表明，长期摄入动物蛋白可能会增加患肥胖症及糖尿病的风险[10]，而植物蛋白与动物蛋白相比，不含胆固醇，更加健康，并能减轻人体肾脏负担[11]；且植物蛋白资源可循环再生，对环境友好[12]，可将其替代或部分替代动物蛋白，满足人体对蛋白质的摄入要求[13]。

该试验通过响应面优化纤维素酶复合碱提酸沉法提取寒葱蛋白的工艺条件，并对所得寒葱蛋白进行营养价值评价，为植物蛋白资源的开发提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2020年夏季采摘新鲜吉林省延边地区的野生寒葱置于55 ℃鼓风干燥箱中烘干，然后用高速多功能粉碎机粉碎后过100目筛，得到寒葱干燥粉，于4 ℃冰箱中保存备用。

牛血清蛋白标准品，购于上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸钠，分析纯，购于河南万邦实业有限公司；其余常规试剂均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-7504可见紫外分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；QFST-250SQ索氏提取器(浙江托普仪器有限公司)；Scientz-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TDZ5-WS离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；L-8900氨基酸自动分析仪(岛津国际贸易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 寒葱蛋白提取工艺

寒葱蛋白的提取参照丘苑新等[14]的方法，取3 g寒葱粉，加入2%的纤维素酶，浸泡于一定比例的水中，并按照单因素相应的试验条件进行试验，将其水解完毕后于80 ℃水浴钝化酶活性，冷却至常温后用0.1 mol/L NaOH调节pH值至10，在50 ℃条件下水浴2.5 h，冷却至常温后在4 000 r/min离心15 min取上清液，进行沉淀复提，合并上述2次上清液，取1 mL用于之后的蛋白质含量测定。用0.1 mol/L HCl将上清液pH值调节至等电点3.5，静置1 h后在4 000 r/min离心15 min取沉淀，使用真空冷冻干燥机干燥48 h即可得到寒葱蛋白粉。

1) 单因素试验

①酶解温度对寒葱蛋白提取率的影响

在酶解时间2 h，料液比1∶50 (g∶mL)条件下，选择酶解温度30、40、45、50、55和60 ℃分别酶解，重复3次，根据最终蛋白质的提取率确定最优酶解温度。

②酶解时间对寒葱蛋白提取率的影响

在酶解温度45 ℃、料液比1∶50 (g∶mL)条件下，分别酶解1、1.5、2、2.5、3和3.5 h，重复3次，根据最终蛋白质的提取率确定最优酶解时间。

③料液比对寒葱蛋白提取率的影响

在酶解温度45 ℃、酶解时间2 h条件下，分别采用料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70 (g∶mL)进行试验，重复3次，根据最终蛋白质的提取率确定最优料液比。

2) 响应面优化设计

在单因素试验的基础上，运用Design-Expert8.0.6进行响应面优化设计，以酶解温度(A)、酶解时间(B)、料液比(C)这3个因素为自变量[15]，以试验中寒葱蛋白提取率的大小为响应面的响应值进行工艺条件优化，相关试验因素水平编码见表1。

表1 响应面因素水平表

1.3.2 蛋白质含量测定

1) 牛血清蛋白标准曲线绘制

取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%H3PO4,用蒸馏水稀释至1 000 mL后，用滤纸于循环水真空泵中抽滤，制得考马斯亮蓝溶液[16]。

配制0.02、0.04、0.06、0.08、1.0 mg/mL牛血清蛋白质溶液。分别吸取1 mL不同浓度的蛋白质溶液于10 mL试管中，再向试管中加入5 mL考马斯亮蓝溶液，震荡混匀，静置2 min。在波长为595 nm处用分光光度计测定不同浓度的牛血清蛋白质吸光度值，以蛋白质标准溶液浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标绘制牛血清蛋白质标准曲线，最终得到回归方程

y=0.507 5x+0.034 9，R2=0.993 7。

2) 蛋白质含量测定方法及提取率计算

吸取1 mL蛋白质提取液置于10 mL试管中，再加入5 mL考马斯亮蓝溶液，震荡混匀，静置2 min，于波长595 nm处测定寒葱蛋白提取液的吸光度值，再根据蛋白标准曲线计算提取液中蛋白质含量[17]。根据凯氏定氮法测定寒葱中蛋白质的总含量。寒葱蛋白提取率[18]计算公式为：

寒葱蛋白提取率/%=提取液中蛋白质含量/寒葱粉末中蛋白质含量×100

(1)

1.3.3 氨基酸含量测定

根据GB/T5009.124-2016规定的试验方法对寒葱蛋白进行氨基酸组分分析。

在水解管中准确称量0.2 g样品，加入10 mL 6 mol/L HCl溶剂，在减压的条件下将水解管密封后放入烘干箱，在110 ℃水解24 h，冷却后过滤水解液，再旋蒸去除盐酸，将所得试样用0.02 mol/L HCl 溶剂定容至50 mL。该试样使用时稀释10倍，取少量稀释后的水解液，再将其过0.02 μm的滤膜过滤，装入进样瓶中放入氨基酸自动分析仪中进行检测。[19-20]

1.3.4 氨基酸营养价值评价方法

根据FAO/WHO共同修订的理想蛋白质人体必需氨基酸模式谱，分析寒葱氨基酸营养价值，具体指标包括：必需氨基酸占总氨基酸的质量分数、氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、氨基酸比值系数(RCAA)、氨基酸比值系数分(SRCAA)、必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)、营养指数(NI)[21-23]，各项指标计算公式如(2)～(8)。由于半胱氨酸与酪氨酸分别由甲硫氨酸和苯丙氨酸转变而成，因此将苯丙氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸与半胱氨酸分别合并计算[24]。

氨基酸评分(AAS)=(Ax/Fx)×100；

(2)

化学评分(CS)=(Ax/Ae)/(Ex/Ee)×100；

(3)

氨基酸比值系数(RCAA)=氨基酸比值/氨基酸比值的均值；

(4)

氨基酸比值系数分(SRCAA)=100-CV×100；

(5)

(6)

生物价(BV)=(1.09×EAAI-11.7)×100;

(7)

营养指数(NI)=EAAI×(Pp/100);

(8)

式中,Ax为待测蛋白质中某一必需氨基酸含量(mg/g)；Fx为FAO/WHO评分标准模式中相应的必需氨基酸含量(mg/g)；Ae待测蛋白质中必需氨基酸总含量(mg/g)；Ex为标准鸡蛋模式中相应必需氨基酸含量(mg/g)；Ee为标准鸡蛋模式中必需氨基酸总含量(mg/g)；氨基酸比值为某一必需氨基酸含量与FAO/WHO模式中相应必需氨基酸含量的比值；CV为RCAA的变异系数，CV=标准差/均数；n为比较的必需氨基酸个数；Pp为待测蛋白质的百分含量。

1.4 数据处理

各项数据均重复试验3次，并使用Excel 2010进行处理；对所得数据结果采用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计；响应面设计结果较为显著，模拟效果良好。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解温度对寒葱蛋白提取率的影响

随着酶解温度的逐渐升高，蛋白质提取率先上升后下降(图1)。当酶解温度处于30～50 ℃时，寒葱蛋白的提取率随酶解温度的升高而显著上升，可能是由于纤维素酶在一定温度范围内，温度越高，酶活性越强，寒葱细胞壁上的纤维素更容易分解，使细胞中蛋白质溶出，且温度的提高会使分子扩散速率加快，由此增加蛋白质溶出含量。当温度为50 ℃时，寒葱蛋白提取率达到峰值53.68%；而随着酶解温度的持续升高，寒葱蛋白提取率下降显著，可能是当温度超过一定限度时，纤维素酶活性受到抑制甚至失活，或是温度过高寒葱蛋白变性导致其溶解性下降，从而蛋白质提取率降低。所以，选择酶解温度42.5～52.5 ℃进行后续试验。

2.1.2 酶解时间对寒葱蛋白提取率的影响

由图2可知，随着酶解时间的逐渐增加，寒葱蛋白的提取率先上升后趋于平缓。当酶解时间为1～2.5 h时，寒葱蛋白提取率随时间的增加而显著上升，可能是因为在该酶解温度和料液比时，提取时间越长，越有利于寒葱蛋白的溶解。而随着酶解时间继续增加，寒葱蛋白提取率基本保持不变，说明此时寒葱蛋白溶解已达最大值，所以蛋白质提取率变化较小；过长的酶解时间会使试验耗时加长。因此，选择酶解时间2～3 h进行后续试验。

2.1.3 料液比对寒葱蛋白提取率的影响

随着料液比的升高，寒葱蛋白提取率呈先上升后下降的趋势(图3)。当溶液料液比为1∶30～1∶40时，寒葱蛋白提取率随料液比升高而显著上升，可能是因为当料液比较低时，原料浓度较高，不利于寒葱蛋白从中析出，所以在这个范围内，随着料液比的增加，寒葱蛋白提取率提高。但随着料液比持续增加时，蛋白质提取率又急剧下降，可能是在料液比较高时，析出的蛋白质成分随杂质一起离心析出，导致提取率下降。因此,选取料液比1∶30～1∶50进行后续试验。

2.2 寒葱蛋白提取工艺优化

利用Box-Behnken[25]共设计出17组试验，相应的响应面设计方案及结果见表2。

液压系统由电机—齿轮泵总成、手动应急泵总成、高压蓄能器总成、阀组总成、管路总成等组成。采用双液压源双回路加蓄能器结构，一套电机—泵总成工作，另一套备用，两套同时出现问题时，可使用手动应急泵应急处理，具有多重保护功能，提高了可靠性和安全性。

表2 响应面试验设计方案及结果

2.2.1 响应面模型的建立与分析

根据Design-Expert 8.0.6对响应面模型结果进行拟合分析，以酶解温度、酶解时间、料液比3个因素为自变量，以寒葱蛋白提取率为响应面响应值的二元回归方程为：Y=44.93-3.11A+2.70B+0.93C-2.64AB-0.55AC-0.69BC-2.82A2-2.45B2-0.70C2。

由表3可知，模型中1次项酶解温度(A)、酶解时间(B)对寒葱蛋白提取率影响极显著，料液比(C)对寒葱蛋白提取率影响不显著；模型中AB对寒葱蛋白提取率影响极显著，AC、BC对寒葱蛋白提取率影响不显著。

表3 回归模型方差分析

此外，模型中F值为16.32，P<0.01，说明响应面模型差异极显著；失拟项P=0.112 6，远大于0.05，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，说明试验方法与设计合理可靠，且其他未知因素对试验影响较小；其中模型决定系数R2=0.954 5，矫正系数R2=0.896 0，说明模拟预测值与真实试验值在试验范围内模拟度良好，所以，回归方程可以用来分析与预测寒葱蛋白提取的工艺结果。根据F值大小可知，影响寒葱蛋白提取率因素的主次顺序为：酶解温度、酶解时间、料液比。

2.2.2 响应面各因素相互作用分析

响应面曲面的凹凸程度反映了各因素对寒葱蛋白提取率影响的大小，响应面曲率越大，说明响应值对于因素大小的变化十分敏感；响应面曲率较小时，说明响应值对于因素大小的变化不敏感。图4a为酶解温度与酶解时间的交互作用结果，可见，寒葱蛋白提取率随温度变化显著，说明适宜的温度对促进蛋白质提取得率提高有着很关键的作用，在实际应用中发挥较为积极的促进作用。而提取时间对提取率的影响也较为显著，说明合适的提取时长也是影响提取率的有效手段之一。

图4b为酶解温度与料液比的交互作用结果，可见料液比在寒葱蛋白提取过程中影响作用不显著，说明提取时加入的水量在试验中作用不大。

2.2.3 最佳工艺验证试验

利用Design-Expert 8.0.6软件优化回归模型进行的工艺参数，确定提取寒葱蛋白的最适工艺条件为酶解温度42.5 ℃，酶解时间3 h，料液比1∶45.6，预测蛋白质提取率为48.32%。为证明响应面优化设计的合理性与可靠性，以上述条件进行3次验证试验，得到的蛋白质提取率为48.23%，这与模型预测值的相对偏差为1.0%，说明该提取条件参数可靠，具有较好的可行性。

2.3 蛋白质营养评价

将最佳工艺提取的蛋白质进行氨基酸组分分析并进行营养评价。由表4可知，寒葱蛋白共测得16种氨基酸，包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸。寒葱蛋白必需氨基酸总量为19.17 mg/g，非必须氨基酸31.47 mg/g，氨基酸总量达50.44 mg/g，必需氨基酸与总氨基酸(EAA/TAA)的比值为0.38，必需氨基酸与非必需氨基酸(EAA/NEAA)的比值为0.62。由此可以看出，寒葱蛋白十分接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式(EAA/TAA≈0.40，EAA/NEAA=0.60)的要求，因此，可确定寒葱蛋白是一种优质植物蛋白。

表4 寒葱蛋白中氨基酸种类及含量

由表5可知，寒葱蛋白中含量最高的必需氨基酸为甲硫氨酸，占氨基酸总量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10.00%，也高于全鸡蛋模式的11.07%。甲硫氨酸在人体的生长发育过程中有着十分重要的作用，根据蛋白质互补理论，可将寒葱蛋白作为食品强化剂，与其他蛋白互补，提高各种食品的营养价值[26-27]，例如，补充大豆等谷物中含量不足的甲硫氨酸。因测得亮氨酸与赖氨酸氨基酸比值系数(RCAA)远小于1，可知这2种氨基酸是寒葱蛋白的限制氨基酸；且亮氨酸为寒葱蛋白的第1限制氨基酸，所以将其评分分别作为寒葱蛋白的化学评分和氨基酸评分[28]，得到寒葱蛋白化学评分为4.78，氨基酸评分为2.57。

由表6对比可知，寒葱蛋白营养价值评价指标较羊肚菌[29]稍高，而羊肚菌是众所周知的营养丰富的食用菌之一，这是寒葱蛋白是一种优质植物蛋白的又一证据。而寒葱蛋白相较于黄豆[30]的各项营养指标较低，由测得数据及计算得知，是寒葱蛋白中限制氨基酸亮氨酸含量过低，影响了寒葱蛋白的必需氨基酸指数EAAI，进而使其余指标值偏低，且亮氨酸含量过低对其中的变异系数影响较大，导致其数值偏低。但其余相关指标符合FAO/WHO制定的氨基酸模式，所以寒葱蛋白为优质植物蛋白的结论仍然正确。

表6 寒葱蛋白营养价值评价

3 结论

该试验通过单因素试验和响应面优化试验对寒葱蛋白的提取工艺进行优化，其最佳工艺参数组合为酶解温度42.5 ℃，酶解时间3 h，料液比1∶45.6，在此条件下进行3次验证试验，最后得到寒葱蛋白提取率为48.23%，与预测值48.32%接近，说明该模型对试验拟合程度较高，工艺合理可靠。将得到的寒葱蛋白进行氨基酸组分分析并进行营养价值评价，可知寒葱蛋白含人体所需的7种必需氨基酸，其中含量最高的必需氨基酸为甲硫氨酸，占氨基酸总量的14.27%，高于FAO/WHO模式的10%，也高于全鸡蛋模式的11.07%。且必需氨基酸与非必须氨基酸的比值为0.62，必需氨基酸与氨基酸总量比值为0.38，由此可知，寒葱蛋白是一种优质的植物蛋白。