张 锐，石凤翎，杨 蕾，彭 新，钱亚斯，崔思宇

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院/农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室/草地资源教育部重点实验室,呼和浩特 010018)

野火球(TrifoliumlupinasterL.)为豆科(Leguminosae)车轴草属(Trifolium)草本植物 ，又称野车轴草、豆参。在我国东北分布有3种，内蒙古地区有2种，包括1变种；在蒙古国、俄罗斯、朝鲜等地也有分布[1]。野生火球常生长于干旱的草原、荒野田地、疏林草原和灌木丛，是适应性较强的草种[2]，可用于人工草地建设和水土保持[3～4]；由于其花色鲜艳和花期长，还可作为观赏植物。另外，从该植物中还发现了黄酮类成分、香豆素、皂苷、芳香挥发性成分、脂肪酸、多糖及其他化合物[5～6]。黄酮类物质是车轴草属植物的主要成分，具有抗氧化活性和调节免疫力、抗过敏等诸多功效[7～8]。前期的研究发现，来自不同地区的野火球种质材料在内蒙古呼和浩特种植，从生育期上表现出早熟和晚熟两种类型，且晚熟材料地上生物量、平均生长速度和生长强度均优于早熟材料[9]。为进一步明确野火球的饲用价值，对两种类型的种质材料在不同生育时期及不同器官组织中的常规养分与总黄酮含量进行了比较分析，为野火球资源的合理利用提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古农业大学新区牧草试验地

(地处40°49′N、114°41′E，海拔1063m)。该区域年平均降水量为335.2～534.6mm，年平均气温5.4℃；7月、8月的降水量约占全年降水总量的50%，平均气温17～22.9℃;无霜期130～140d，具备灌溉条件。

1.2 试验材料

供试材料为生长第2～3年的野火球早熟与晚熟种质材料，分别在其分枝期、现蕾期、开花期和种熟期取样，并于开花初期刈割，一个月后取其再生草，将各时期单株茎、叶、花分离，风干后用球磨仪打磨成100目，于干燥阴凉处保存备用。

1.3 研究内容和测定方法

1.3.1各器官形态及主要生长特性

在各供试材料生长第2～3年的6月初(早熟材料为开花期，晚熟材料为分枝期)，随机刈割各材料5株，留茬高度10～15cm。观察并测定其株高、茎叶形态及其占比、单株分枝数及生物量。刈割生长一个月后，对其再生草的营养成分含量以及总黄酮含量进行测定。

1.3.2营养成分含量测定

刈割各物候期2份材料，自然风干后粉粹过筛，测定其常规养分含量。用传统半微量凯氏定氮法，通过对待测样品消化、蒸馏后以甲基红-溴甲酚绿作为指示剂，用盐酸标准滴定溶液进行滴定并计算其粗蛋白(CP)含量[10]；索氏浸提法测定粗脂肪(EE)含量[11]；基于滤袋技术改进的范氏酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维测定法测定酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量[12]；马福炉分析法(灰化法)测定粗灰分(Ash)；依据GB/T13885-2017标准测定钙(Ca)含量及有机质(OM)含量。

1.3.3总黄酮含量测定

总黄酮含量参照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》方法测定[13～14]。

1.4 统计学分析

试验验数据采用SPSS(18.0版本)进行分析，两组间均数采用独立样本T检验，不满足方差齐性则采用独立样本非参数检验。

2 结果与分析

2.1 两种种质材料茎叶形态与生长特性

在同一观察期内两份材料表现出明显的形态和生长差异。由表1可知，早熟材料进入开花盛期时晚熟材料还处于分枝期；晚熟材料茎粗、叶大、叶色深绿。由表2可知，晚熟材料的枝条长度和叶茎比及生物量明显高于早熟材料(P<0.01)。两者在形态与生长特性上均有较大差异，这些差异将会直接导致其化学成分的差异。

表1 两种野火球种质材料茎叶形态

表2 两种野火球种质材料单株生长特性

2.2 两种种质材料不同生育期的营养成分

由表3可知，两种种质材料分枝期和开花期的蛋白质含量均显著高于种熟期(P<0.05)，分枝期的酸性洗涤纤维含量(35.51～35.78%)均显著低于其余时期(P<0.05)，种熟期的中性洗涤纤维含量(59.53～59.95%)均高于其余时期。野火球早熟材料分枝期的有机质、粗蛋白质含量均高于晚熟材料；而晚熟材料现蕾期与种熟期的粗脂肪含量(2.90～2.93%)、开花期的酸性洗涤纤维含量(52.42%)和分枝期的钙含量(2.02%)均较高。

表3 不同生育时期野火球种质材料的营养成分含量(% DM)

为合理利用野火球资源，在分枝期对野火球早熟材料和晚熟材料进行刈割，测定了再生草的营养成分。再生草(第二茬)与第一茬草的各项营养成分均有变化，其中早熟材料刈割后再生草的有机质、粗蛋白质和钙含量均有增加，晚熟材料的粗蛋白质、粗脂肪和钙含量均有增加，而纤维含量都显著降低(P<0.05)。总体表现出再生草的营养价值高于第一茬草(表4)。

表4 早熟与晚熟材料再生草的营养成分含量(% DM)

2.3 两种种质材料不同生育期的总黄酮含量

植物体内总黄酮类化合物的含量随着植物的生长发育出现动态变化。为深度开发和利用野火球资源，分别在分枝期、现蕾期、开花期和种熟期取样，检测总黄酮类化合物的含量。由表5可知，早熟材料的总黄酮类化合物含量在现蕾期达到最高(8.223mg/g)，均显著高于其他生育时期，在种熟期总黄酮类化合物含量最低(5.952mg/g)；晚熟材料的总黄酮类化合物含量在分枝期含量最高(为7.694mg/g)，而开花期含量最低(6.037mg/g)。野火球早熟材料的黄酮类化合物总量显著(P<0.05)高于晚熟材料，其中晚熟材料在分枝期和种熟期具有较高的总黄酮含量。这种差异的产生，可能与两种种质材料生育期所处的环境条件不同有关。

表5 两种种质材料不同生育时期总黄酮含量(%DM)

由表6可知，两种种质材料的第一茬草和第二茬草总黄酮含量也有较大变化。两茬草总黄酮含量晚熟材料显著(P<0.05)高于早熟材料；第二茬草总黄酮含量显著(P<0.05)高于第一茬草，其中早熟材料第二茬草与晚熟材料第一茬草的含量相当。

表6 两种野火球种质材料再生草总黄酮含量

3 讨论

3.1 野火球不同生育期常规养分与总黄酮含量的关系

在营养成分方面，野火球不同生育期粗脂肪和钙含量没有差异，其原因是受当地环境和土壤中元素含量的影响。随着植物成长生育期不断推进，植物木质部和韧皮部生长，粗蛋白质、有机质含量增加明显，纤维含量具有明显差异。气候变化对牧草生长发育有较大影响[15～16]。

不同物候期的植物，在积累营养物质上有着显著差别。豆科植物体内异黄酮类化合物的积累，尤其易受到环境因素和遗传因素的影响[17]。异黄酮在植物体内由苯丙烷次生代谢途径进行生物合成，从苯丙氨酸出发，由苯丙氨酸解氨酶作用下脱去氨基得到肉桂酸，肉桂酸在一系列酶作用下得到香豆酸，香豆酸在香豆素辅酶连接酶、查尔酮合酶作用下经过缩合反应得到4-羟基查尔酮为代表的一系列异黄酮类化合物。调控苯丙烷类代谢途径可以影响异黄酮在大豆中的合成，通过基因修饰等工作促进植物体内异黄酮类化合物的积累。对不同生育期大豆异黄酮合成相关的基因表达差异进行分析显示，植物体内异黄酮含量与异黄酮合成相关酶的表达量直接存在较为显著的相关关系，且在不同器官中相关基因的表达存在差异，这是导致不同器官在同一时期含有的营养物质量不同的主要原因[18]；幼苗期时子叶中异黄酮含量明显低于根茎，而壮苗期时叶片增多，叶中异黄酮含量增加，在盛花期时叶片中异黄酮含量已超过根茎中异黄酮含量。在大豆发芽后，种子中的异黄酮由富含营养物质的子叶向根茎中转移，随着大豆幼苗成长营养物质又重新由根茎输送回叶中。不同营养物质在不同时期在组织间存在代谢转移，使得测定的营养物质含量发生变化[19]。本研究发现，野火球不同生育时期的两种种质材料总黄酮类化合物的含量不尽相同，早熟野火球总黄酮含量顺序为现蕾期>开花期>分枝期>种熟期，晚熟野火球总黄酮含量顺序为分枝期>种熟期>现蕾期>开花期。晚熟材料在分枝期具有较高的总黄酮含量，与其蛋白质含量变化趋势一致，而早熟材料则相反。

3.2 野火球早熟与晚熟材料养分差异与利用方式

野火球与三叶草属其他主要物种相比，其开花期粗蛋白质含量和粗脂肪含量均低于红三叶、白三叶、降三叶和杂三叶[20]，但其总黄酮含量显著高于红三叶[9]，这可能与各物种营养物质的转化等有关。野火球早熟材料与晚熟材料由于各生育时期所处环境条件(主要是温度、光照、雨水)的不同，导致其在相同生育时期各化学成分的差异，因此从资源利用最优化出发应在各物质含量较高的生育时期收割利用。为此，建议野火球早熟材料分枝期饲用，现蕾至开花期药用；晚熟材料在分枝期至现蕾期饲用。无论是药用还是饲用，其再生草均具有较高的利用价值。

4 结论

4.1野火球早熟材料花盛期为晚熟材料分枝期，晚熟材料的枝条长度和叶茎比明显高于早熟材料。

4.2野火球晚熟材料粗蛋白质、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和钙含量及总黄酮类化合物含量均高于早熟材料。

4.3野火球早熟材料和晚熟材料再生草的营养物质与总黄酮含量均高于第一茬草；在利用上晚熟材料在分枝期至现蕾期易饲用，早熟材料分枝期易饲用而现蕾至开花期药用。