高娟，邢海洲

（郑州大学第一附属医院血液病实验室，河南 郑州 450052）

淋巴瘤是血液系统恶性肿瘤，弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是常见的恶性淋巴瘤，目前临床上多采用利妥昔单抗联合化疗的治疗方法，因治疗手段单一且部分患者易复发，所以需要研发新的治疗手段，为患者临床治疗提供新方向[1,2]。 沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是一种传统中药，含有多种天然活性物质，其提取物主要有类胡萝卜素、黄酮类化合物、多糖和沙棘油等，具有杀菌、抗氧化、增加免疫力、抗癌抑瘤等作用[3]。 有研究发现沙棘总黄酮可增强心功能和对血管内皮细胞保护作用，从而发挥抗心肌缺血的作用[4]。 沙棘黄酮可抑制人前列腺癌PC-3 细胞增殖，并诱导细胞凋亡[5]。 但沙棘提取物对淋巴瘤细胞增殖、凋亡的影响还尚未清楚。 CD68是巨噬细胞的表面抗原标记，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage，TAM）是淋巴瘤微环境的重要成分，TAM 数量在DLBCL 中增高，是其预后不良的指标[6]。 有研究发现CD68 在原发性中枢神经系统淋巴瘤中高表达，与较差的总体存活和无进展存活相关，影响患者预后[7]。 胃癌组织中CD68 过表达，可作为判断胃癌病情的参考指标[8]。本实验旨在研究沙棘提取物对淋巴瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制是否与CD68 有关。 为淋巴瘤的治疗提供新思路和参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人B 淋巴瘤细胞Raji 购自上海君瑞生物技术有限公司。 沙棘提取物购自西安天瑞生物有限公司； 胎牛血清、RPMI1640 培养基购自美国Gibco 公司；LipofectamineTM 2000 转染试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒购自美国Invitrogen 公司； 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、ECL 化学发光液购自碧云天生物技术研究所；抗体购自美国Sigma 公司；载体质粒购自上海基屹生物科技有限公司。 Thermo FC 酶标仪购自美国Thermo 公司；FACS caliber 流式细胞仪购自美国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人B 淋巴瘤细胞Raji 复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中，在37℃、5%CO2的恒温箱中培养，1～2d 换一次新鲜培养液，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞处理与分组 取对数生长期细胞Raji，无血清培养12h 后分别加入终浓度为0.185mg/m、0.37mg/m、0.74mg/m 的沙棘提取物，作为沙棘提取物低、中、高浓度（HrL-L、HrL-M、HrL-H）组；未添加药物的细胞作为正常对照（Con）组。 将CD68 干扰载体阴性对照（si-NC）、CD68 干扰载体（si-CD68）转染至细胞Raji 中，记为si-NC 组、si-CD68组；CD68 过表达载体阴性对照（pcDNA3.1）、D68过表达载体（pcDNA3.1-CD68）转染至细胞Raji 后再用0.74mg/ml 的沙棘提取物处理，记为HrL-H+pcDNA3.1 组、HrL-H+pcDNA3.1-CD68 组。 转染按照Lipofectamine TM 2000 转染试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 蛋白质印迹（Western Blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（P21）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、CD68 蛋白表达水平 各组细胞培养48 h 后提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度后取40 μg 总蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用5%脱脂奶粉室温封闭2h，再分别加入一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗膜； 加入二抗室温孵育90 min，TBST 洗涤3 次，用ECL 化学发光液显像，用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。 每个蛋白样品设3 个重复。

1.2.4 MTT 试剂盒检测细胞活性 各组细胞培养至48h 时分别加入5mg/ml 的MTT 溶液20μl，37℃孵育4h；弃去培养液，每孔加入150μl DMSO 后振荡反应15 min，然后用酶标仪于490nm 波长处检测各孔吸光度（A）值。 细胞活性（%）=实验组A 值/空白对照组A 值×100%。 实验重复3 次，每次设3个复孔。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h 后用PBS 漂洗2 次，加500 μl 结合缓冲液重悬细胞。 按照试剂盒说明书，先后加入Annexin VFITC 和PI 避光孵育。 流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3 次，每次设3 个复孔。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 20.00 进行统计学分析。 计量资料以±s 表示，两组比较行t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沙棘提取物对细胞Raji 增殖的影响 与对照组相比，随着沙棘提取物浓度的升高，细胞Raji 中Cyclin D1 表达水平逐渐显著降低，P21 表达水平逐渐显著升高,细胞活性逐渐显著降低（P＜0.05），见图1，表1。 可见,沙棘提取物可抑制细胞Raji 增殖，且呈浓度依赖性。 选用抑制作用较为明显的沙棘提取物浓度0.74 mg/ml, 即HrL-H 用做后续实验。

表1 沙棘提取物对细胞Raji 增殖的影响（±s，n=9）

表1 沙棘提取物对细胞Raji 增殖的影响（±s，n=9）

注：与Con 组比较，*P＜0.05；与HrL-L 组比较，#P＜0.05；与HrL-M 组比较，&P＜0.05。Con：未用药物处理的细胞；HrL-L：沙棘提取物0.185 mg/mL；HrL-M：沙棘提取物HrL 0.37 mg/mL；HrL-H：沙棘提取物0.74 mg/ml。

分组 Cyclin D1 P21 24h细胞活性（490 nm）48h 72h Con HrL- L HrL- M HrL- H FP 0.74±0.07 0.60±0.06*0.43±0.04*#0.21±0.02*#&178.857 0.000 0.14±0.01 0.18±0.02*0.29±0.03*#0.50±0.05*#&240.231 0.000 0.53±0.05 0.43±0.04*0.34±0.03*#0.22±0.02*#&116.000 0.000 0.86±0.09 0.69±0.07*0.55±0.05*#0.38±0.04*#&87.719 0.000 1.21±0.12 0.92±0.09*0.72±0.07*#0.59±0.06*#&84.619 0.000

图1 沙棘提取物对细胞Raji 增殖蛋白表达的影响

2.2 沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的影响 与Con相比，HrL-H 组细胞Raji 中Bax 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2，表2。可见，沙棘提取物促进细胞Raji 凋亡。

图2 沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的影响

表2 沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的影响（±s，n=9）

表2 沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的影响（±s，n=9）

注：与Con 组比较，*P＜0.05。

分组Con HrL-H t P Bax Bcl-2 0.23±0.02 0.78±0.08*20.009 0.000 0.81±0.08 0.33±0.03*16.854 0.000凋亡率（%）7.83±0.78 23.24±2.41*18.251 0.000

2.3 沙棘提取物对细胞Raji 中CD68 表达的影响与Con 相比，HrL-H 组细胞Raji 中CD68 表达 水平显著降低（P＜0.05）,见图3，表3。 可见，沙棘提取物抑制细胞Raji 中CD68 表达。

图3 沙棘提取物对细胞Raji 中CD68 蛋白表达的影响

表3 沙棘提取物对细胞Raji 中CD68 表达的影响（±s，n=9）

表3 沙棘提取物对细胞Raji 中CD68 表达的影响（±s，n=9）

注：与Con 组比较，*P＜0.05。

分组 CD68 Con HrL-H t P 0.85±0.08 0.27±0.03*20.365 0.000

2.4 抑制CD68 对细胞Raji 增殖、凋亡的影响 与si-NC 组相比，si-CD68 组细胞Raji 中CD68 表达水平显著降低，Cyclin D1、Bcl-2 表达水平显著降低，P21、Bax 表达水平显著升高，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图4，表4，表5。 可见，抑制CD68 表达抑制细胞Raji 增殖、促进细胞凋亡。

表4 抑制CD68 对细胞Raji 增殖的影响（±s，n=9）

表4 抑制CD68 对细胞Raji 增殖的影响（±s，n=9）

注：与si-NC 组比较，*P＜0.05。

分组 CD68 Cyclin D1 P21 24h细胞活性（490 nm）48h 72h si- NC si- CD68 t P 0.82±0.08 0.34±0.03*16.854 0.000 0.73±0.07 0.27±0.03*18.120 0.000 0.12±0.01 0.41±0.04*21.101 0.000 0.52±0.05 0.29±0.03*11.833 0.000 0.88±0.09 0.46±0.05*12.238 0.000 1.23±0.12 0.71±0.07*11.229 0.000

表5 抑制CD68 对细胞Raji 凋亡的影响（±s，n=9）

表5 抑制CD68 对细胞Raji 凋亡的影响（±s，n=9）

注：与si-NC 组比较，*P＜0.05。

分组si-NC si-CD68 t P Bax Bcl-2 0.21±0.02 0.65±0.06*20.871 0.000 0.82±0.08 0.47±0.05*11.130 0.000凋亡率（%）7.86±0.78 19.67±2.11*15.750 0.000

图4 抑制CD68 对细胞Raji 增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.5 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji增殖的抑制作用与Con 相比，HrL-H 组细胞Raji中CD68 表达水平显著降低，Cyclin D1 表达水平显著降低，P21 表达水平显著升高，细胞活性显著降低（P＜0.05）；与HrL-H+pcDNA3.1 组相比，HrLH+pcDNA3.1-CD68 组细胞Raji 中CD68 表达水平显著升高，Cyclin D1 表达水平显著升高，P21 表达水平显著降低，细胞活性显著升高（P＜0.05），见图5，表6。 可见，过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 增殖的抑制作用。

表6 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 增殖的抑制作用（±s，n=9）

表6 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 增殖的抑制作用（±s，n=9）

注：与Con 组比较，*P＜0.05；与HrL-L 组比较，#P＜0.05。

分组 CD68 Cyclin D1 P21 24h细胞活性（490 nm）48h 72h Con HrL- H HrL- H+pcDNA3.1 HrL- H+pcDNA3.1- CD68 F P 0.84±0.08 0.27±0.03*0.28±0.03 0.67±0.07#224.336 0.000 0.73±0.07 0.21±0.02*0.23±0.02 0.58±0.06#258.936 0.000 0.14±0.01 0.50±0.05*0.52±0.05 0.20±0.02#256.582 0.000 0.53±0.05 0.22±0.02*0.23±0.02 0.43±0.04#171.612 0.000 0.88±0.09 0.38±0.04*0.36±0.04 0.69±0.07#141.093 0.000 1.23±0.12 0.59±0.06*0.61±0.06 0.93±0.09#111.354 0.000

图5 增殖相关蛋白的表达

2.6 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji凋亡的促进作用 与Con 相比，HrL-H 组细胞Raji中Bax 表达水平显著升高，Bcl-2 表达水平显著降低,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与HrL-H+pcDNA3.1 组相比，HrL -H +pcDNA3.1-CD68 组细胞Raji 中Bax 表达水平显著降低，Bcl-2 表达水平显著升高,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图6,表7。 可见，过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的促进作用。

表7 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的促进作用（±s，n=9）

表7 过表达CD68 能逆转沙棘提取物对细胞Raji 凋亡的促进作用（±s，n=9）

注：与Con 组比较，*P＜0.05；与HrL-L+pcDNA3.1 组比较，#P＜0.05。

分组Con HrL-H HrL-H+pcDNA3.1 HrL-H+pcDNA3.1- CD68 FP Bax Bcl-2 0.23±0.02 0.79±0.08*0.82±0.08 0.36±0.03#228.936 0.000 0.81±0.08 0.32±0.03*0.31±0.03 0.65±0.06#188.212 0.000凋亡率（%）7.83±0.78 23.43±2.45*24.58±2.52 10.06±1.10#194.719 0.000

图6 凋亡相关蛋白的表达

3 讨论

DLBCL 是常见的非霍奇金淋巴瘤亚型, 具有高度异质性[9];研究发现中药在DLBCL 的治疗中有一定作用[10]。 沙棘作为传统中药，具有增强免疫力和抗肿瘤的作用, 研究报道沙棘总黄酮可刺激NK92-MI 细胞激活, 增强NK92-MI 细胞对K562细胞的杀伤力[11]。 沙棘叶提取物可以保护神经元PC-12 细胞免受氧化应激[12]。 沙棘浆果的同型半乳糖醛酸通过TLR4/MyD88 途径介导的巨噬细胞活化增强免疫调节活性[13]。 沙棘水提物可减轻短波紫外线辐射对人角质形成细胞HaCaT 的氧化损伤，抑制HaCaT 细胞凋亡、促进细胞增殖，且呈剂量依赖[14]。 本实验结果显示，沙棘提取物处理的人B 淋巴瘤细胞Raji 中细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）表达水平显著降低，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，P21）表达水平显著升高，Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达水平显著升高，B 细胞淋巴瘤/白血病-2 （B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表达水平显著降低；细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高。 Cyclin D1 是细胞周期正调控因子，高表达促进细胞异常增殖，P21 是细胞周期负调控因子，抑制细胞增殖；Bax 是促凋亡因子，Bcl-2 是抑凋亡因子，有研究发现抗凋亡的BCL-2 在DLBCL 细胞系和患者中高表达[15]。 本实验结果说明沙棘提取物可抑制人B 淋巴瘤细胞Raji 增殖，促进细胞凋亡。

研究发现CD68 在DLBCL 中高表达，CD68 高表达的淋巴瘤患者预后较差，其可作为淋巴瘤患者的预后指标[16]。 乳腺癌组织中CD68 蛋白表达升高，参与了乳腺癌的发生、发展及复发[17]。 CD68 在胃癌组织中高表达，且其表达水平随着淋巴结转移情况、临床分期增高而增高，与胃癌的增殖、侵袭和转移密切相关[18]。 本实验结果显示，抑制CD68表达后，Cyclin D1、Bcl-2 表达水平显著降低，P21、Bax 表达水平显著升高，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高。 说明抑制CD68 表达可抑制人B淋巴瘤细胞Raji 增殖，促进细胞凋亡。 且本研究还发现，沙棘提取物处理的细胞Raji 中CD68 表达水平显著降低，而过表达CD68 逆转了沙棘提取物对细胞Raji 增殖抑制和凋亡促进作用。 提示，沙棘提取物可能通过下调CD68 的表达影响细胞Raji 的增殖和凋亡。

综上所述，沙棘提取物可抑制人B 淋巴瘤细胞Raji 增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与CD68的表达有关。 将可为淋巴瘤的诊断与治疗提高新思路和新途径。