徐双，李荣，冯君阳

（南阳医学高等专科学校第一附属医院妇科，河南 南阳 473000）

卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，也是导致我国女性死亡的常见恶性肿瘤之一。临床上卵巢癌很难做到早期诊断，同时因其易发生腹腔种植转移，60%以上的患者发现时已处于癌症晚期，预后较差[1]。 尽管现阶段卵巢的手术和化疗方案已显著发展，但卵巢癌的生存率仍较低，既往研究表明晚期卵巢癌患者5年生存率仅达30%左右[2]。 因此探索卵巢癌发生发展中的分子机制，可为卵巢癌的诊断、 治疗以及预后评估提供理论基础，具有重要的临床意义。 miRNA 是一种小分子非编码RNA，多项研究表明miRNA 可能与肿瘤的发生发展密切相关，参与调控肿瘤的增殖、凋亡、转移等过程[3]。 目前针对卵巢癌相关研究多集中于miR-21、miR-141、miR-214 等分子表达，并证实了miRNA 对卵巢癌具有诊断意义。 miR-26b、miR-1182 均是miRNA 调控网络的重要组成部分，且已有研究表明在肝癌、 胃癌等疾病中具有重要调控作用[4,5]。 但目前国内关于miR-26b、miR-1182 在卵巢癌发生发展中是否存在异常表达、 以及与卵巢癌组织病理特征和预后关系的研究较为少见。 基于此，本研究分析miR-26b、miR-1182 在卵巢癌组织中的表达及其临床意义，以探讨上述分子在卵巢癌发生发展中可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析本院2015年5月-2017年4月收治的85 例卵巢癌患者（恶性组）临床资料。 纳入标准：⑴符合卵巢癌诊断标准[6]，且经病理学诊断确诊；⑵既往未进行放化疗等治疗；⑶临床资料完整。 排除标准： ⑴合并其他恶性肿瘤者；⑵合并严重基础疾病者；⑶术后随访失访者。另选取同期本院收治的良性上皮性卵巢肿瘤患者70 例（良性组）和来本院进行检查的健康人65 例（健康组）作为对照，其中良性组患者均经病理学诊断确诊，排除合并其他恶性肿瘤者；健康组为因子宫肌瘤而行正常卵巢切除者。 恶性组患者年龄32～70岁，平均54.85±4.67岁；病理类型：浆液性癌49 例、 粘液性癌25 例、 其他11 例；FIGO 临床分期：Ⅰ期18 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期9 例；分化程度：低分化38 例，中分化29 例，高分化18例。 良性组年龄35～68岁，平均55.74±5.12岁；病理类型：浆液性囊腺瘤37 例,粘液性囊腺瘤33 例。健康组年龄30～70岁,平均54.18±5.83岁。 三组患者年龄比较无统计学意义,具有可比性（P＞0.05）。本次研究标本采集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 检测方法 仪器和试剂： 美国BIO-RED 公司生产的实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）扩增仪，天根生化科技公司生产的miRNA 逆转录试剂盒和总RNA 提取试剂盒、美国TheroFisher 公司生产的酶标仪、 德国SIGMA 公司生产的低温高速离心机和振荡器等。

miR-26b、miR-1182 表达水平检测：⑴总RNA提取：切取4 片厚度为10um 的石蜡标本，加入1ml二甲苯并混匀，50℃水浴3min，离心2min，去掉二甲苯，上述操作重复1 次。 加入1ml 总RNA 提取试剂，15℃水浴5min，4℃12000rpm 离心10min，留取水相；加入等体积异丙醇，室温静置20min，4℃12000rpm 离心10min，去除上清液；加入1ml75%乙醇溶液洗涤沉淀，4℃5000rpm 离心3min，留取下层沉淀；室温静置3min，加入50μl 去离子水，充分溶解RNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度计检测其合格性。 将提取的RNA 于-70℃保存。 ⑵反转录反应：在冰浴的1.5mlEP 管内置入miR-26b 或miR-1182 逆转录引物1ul、U6 逆转录引物1μl、dNTP2μl、RNA5μl、 去离子水加至14.5μl，混匀后离心，70℃水浴10min，冰浴2min，4℃静置10min。 然后加入5×First-strand Buffer 4ul、RNasin0.5μl、TIAN Script M -MLV 1μl、 去离子水30μl，混匀后离心，42℃温浴5min，95℃加热5min 后终止反应。 ⑶PCR 反应：采用miRNA 特异性RT 引物对RNA 进行逆转录反应，U6 引物、miR-26b 引物和miR-1182 引物序列见表1。 PCR反应体系：5μl 反转录反应液、1μl 的miR-1182/miR-26b 引物 或者U6 引 物，7.5μl 的H2O 以及10ul 的Sybr Green premix Ex taq。先在95℃下进行预变性、 变性，然后调整温度为60℃进行退火延伸，时长分别为30s、5s、30s，循环40 次，最后以72℃进行延伸10min。 实验重复3 次，反应结束后由计算机自动计算均值。

表1 U6 引物、miR- 26b 引物和miR- 1182 引物序列

1.3 评估指标 比较三组患者miR-26b、miR-1182水平，分析miR-26b、miR-1182 表达与卵巢癌组织病理特征关系；术后随访40 个月，根据患者预后情况将卵巢癌患者分为生存组和死亡组，比较两组患者miR-26b、miR-1182 水平，并分析miR-26b、miR-1182 表达对于预后的预测价值。

1.4 统计学处理 利用SPSS20.0 统计学软件对所有数据进行统计学处理，计数资料以n（%）表示，行χ2或连续性校正χ2检验； 计量资料以表示，多组间比较行单因素-方差分析，两组间比较行t 检验； 采用ROC 曲线分析miR-26b、miR-1182 表达对于预后的预测价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者miR-26b、miR-1182 水平比较 恶性组患者miR-26b、miR-1182 水平均显著低于良性组和健康组患者（P＜0.05）。 见表2。

表2 三组患者miR- 26b、miR- 1182 水平比较（±s）

表2 三组患者miR- 26b、miR- 1182 水平比较（±s）

组别 例数恶性组良性组健康组85 70 65 FP miR-26b 0.31±0.11 1.10±0.15 1.07±0.13 933.368＜0.001 miR-1182 0.68±0.21 2.95±0.35 3.02±0.32 1606.152＜0.001

2.2 miR-26b、miR-1182 表达与卵巢癌组织病理特征关系 不同年龄以及病理类型患者miR-26b、miR-1182 表达水平比较无显著差异（P＞0.05），但不同分化程度以及FIGO 临床分期患者miR-26b、miR-1182 表达水平存在显著差异，具体表现为低分化＜中分化＜高分化，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期＞Ⅳ期（P＜0.05）。 见表3。

表3 miR- 26b、miR- 1182 表达与卵巢癌组织病理特征关系（±s）

表3 miR- 26b、miR- 1182 表达与卵巢癌组织病理特征关系（±s）

病理特征 例数 miR- 1182 t/F P年龄t/F P 0.822 0.413 0.438 0.662病理类型＜50岁≥50岁浆液性癌粘液性癌其他3.093 0.051 0.251 0.779分化程度37.090＜0.001 34.389 57.8＜0.001 17.85 FIGO 临床分期低中高Ⅰ期30.801＜0.001 27.177＜0.001Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期47 38 49 25 11 38 29 18 18 30 28 9 miR- 26b 0.30±0.12 0.32±0.10 0.37±0.13 0.33±0.12 0.27±0.12 0.20±0.09 0.36±0.12 0.46±0.14 0.48±0.14 0.36±0.12 0.20±0.09 0.15±0.08 0.67±0.23 0.69±0.18 0.69±0.19 0.68±0.25 0.64±0.21 0.41±0.15 0.73±0.21 1.23±0.34 0.96±0.29 0.78±0.24 0.52±0.15 0.28±0.13

2.3 miR-26b、miR-1182 表达分别于FIGO 临床分期、分化程度的相关性 miR-26b 表达与分化程度呈正相关（r=0.784），与FIGO 临床分期呈负相关（r=-0.757）；miR-1182 表达与分化程度呈正相关（r=0.860），与FIGO 临床分期呈负相关（r=-0.776）（P 均＜0.05）。 见图1-4。

图1 miR- 26b 表达与分化程度关系

2.4 不同预后患者miR-26b、miR-1182 水平比较生存组患者miR-26b、miR-1182 水平均显著高于死亡组患者（P＜0.05）。 见表4。

表4 不同预后患者miR- 26b、miR- 1182 水平比较（±s）

表4 不同预后患者miR- 26b、miR- 1182 水平比较（±s）

组别 例数生存组死亡组52 33 t P miR-26b 0.39±0.13 0.18±0.08 8.323＜0.001 miR-1182 0.91±0.27 0.32±0.11 11.920＜0.001

图2 miR- 1182 表达与分化程度关系

图3 miR- 26b 表达与临床分期关系

图4 miR- 1182 表达与临床分期关系

2.5 miR-26b、miR-1182 表达对患者预后的预测价值 miR-26b 和miR-1182 预测预后的ROC 曲线下面积分别为0.918、0.982，其中miR-26b 的特异度为90.90%，敏感度为80.80%；miR-1182 的特异度为97.00%，敏感度为94.20%，miR-26b 和miR-1182 表达均对卵巢癌患者预后具有较好的预测价值（P＜0.05）。 见图5。

图5 miR- 26b、miR- 1182 表达预测预后的ROC 曲线

3 讨论

流行病学调查显示，卵巢癌发病率逐年上升，且趋于年轻化，现已成为导致妇科恶性肿瘤死亡的首要原因[7]。 卵巢肿瘤因增长缓慢，且卵巢位于盆腔深处，缺乏特异性的症状以及有效的早期诊断方法，导致部分患者发现时已处于晚期，失去治疗机会。 但临床实践表明早期发现和治疗可提高患者生存率。 故阐明卵巢癌发生发展的分子机制，并寻求有效的早期诊断指标是改善患者预后的关键。 miRNA 在卵巢癌的研究尚处于初级阶段，迄今为止，已发现多种miRNA 在卵巢癌组织中存在异常表达，由于miRNA 具有靶向基因的反向调控功能，广泛参与到细胞生长、分化和凋亡的调控中[8]。因此，研究miRNA 在肿瘤组织中的表达对于诊断以及预后评估具有重要的临床意义。

miR-26b、miR-1182 均属于miRNA 家族，研究发现miR-26b、miR-1182 在前列腺癌、肺癌等恶性中肿瘤的发生发展中均具有重要调节作用，且在上述癌组织中表达情况往往下调,可能具有抑癌基因作用[9,10]。 然而，关于miR-26b、miR-1182 对卵巢癌的作用研究并不多见。 在本研究中，通过荧光实时定量PCR 法对卵巢癌组织、 良性卵巢肿瘤组织以及正常卵巢组织的miR-26b、miR-1182 表达水平进行检测, 结果显示卵巢癌组织中的miR-26b、miR-1182 表达水平相比于正常以及良性卵巢组织均明显下调，提示卵巢癌中miR-26b、miR-1182 表达存在失调，可能作为抑癌因子参与了卵巢癌的发生。 李励[11]、李维[12]等人研究也有此结论，与本研究结果相一致。 进一步分析miR-26b、miR-1182 表达与卵巢癌病理组织特征的关系，结果显示不同分化程度以及FIGO 临床分期患者miR-26b、miR-1182 表达水平存在显著差异，具体表现为低分化＜中分化＜高分化,Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期＞Ⅳ期,提示miR-26b、miR-1182 在卵巢癌细胞的生长、分化中也起到重要作用。 分析其原因，Lin J[13]等人通过动物实验表明过表达miR-26b 可下调OCT4、波形蛋白并上调E-钙粘蛋白，诱导细胞凋亡以及细胞周期阻滞；miR-26b 可通过与靶基因互补结合，在转录后对靶基因的表达进行调控，或者对靶蛋白的翻译过程产生抑制作用,从而参与到癌细胞的分化、增殖等病理过程中。 Hou XS[14]等人通过体外实验表明miR-1182 与hTHRT 表达在卵巢癌组织中存在相关性，而hTHRT 及其下游信号分子激活是导致卵巢癌发展的重要机制, 故推测miR-1182可能通过靶向调节hTHRT，导致其下游信号通路改变，从而来发挥对卵巢癌增殖、 侵袭能力的调控。 国内部分学者研究也表明miR-26b、miR-1182表达与卵巢癌患者的临床分期、 分化程度具有一定关系[12,15],但本研究在此基础上通过spearman 相关性深入分析，发现iR-26b、miR-1182 表达均与分化程度呈正相关，与FIGO 临床分期呈负相关。此外，本研究根据术后随访结果对不同预后患者miR-26b、miR-1182 表达水平进行比较分析，结果显示miR-26b 和miR-1182 预测预后的ROC 曲线下面积分别为0.918、0.982，其中miR-26b 的特异度为90.90%，敏感度为80.80%；miR-1182 的特异度为97.00%，敏感度为94.20%，提示miR-26b、miR-1182 低表达对于卵巢癌患者预后具有一定的预测价值，这也是本研究的创新之处。

综上所述，miR-26b、miR-1182 在卵巢癌组织中明显低表达，且与癌组织的临床分期、分化程度以及预后密切相关，有望成为卵巢癌早期诊断以及预后预测的生物标志物。