胡长容,周艳艳,付佳琳,任静雯,刘阳阳,黄旭博,袁俊俊

(1.河南中医药大学,河南 郑州 450002;2.河南省中医院,河南 郑州 450002;3.中国中医科学院广安门医院,北京 102618)

卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)是指卵巢内卵母细胞的数量减少和/或质量下降,伴抗苗勒管激素(AMH)水平降低、窦卵泡数(AFC)减少、卵泡刺激素(FSH)水平升高,表现为生育能力下降,但不强调年龄、病因和月经改变[1]。目前,该病趋于年轻化,如果未能及早发现并治疗,可在1～6年内发展为卵巢早衰甚至卵巢功能衰竭[2]。西医常采用激素替代疗法(HRT)和辅助生殖技术(ART)治疗,但存在周期取消率高、临床妊娠率、抱婴率低等情况[3]。DOR可归于中医“月经过少”“闭经”“不孕症”“绝经前后诸证”等范畴。基于“治未病”思想,对于DOR患者应做到早诊断、早治疗,发挥中医药特色,积极调整其月经,保留育龄期女性的剩余卵巢功能,改善妊娠结局。

仙茅-淫羊藿药对始载于«本草纲目»,是上海中医药大学张伯讷教授创制的二仙汤中的核心组方,是常用的补肾阳药对。研究表明,淫羊藿中的主要有效成分淫羊藿苷和仙茅中的仙茅乙醇提取物均有类激素样双向调节作用[4]。周艳艳教授认为,DOR的病因责之于肾阴阳两虚,肾精、肾阴是卵泡生长发育的物质基础,肾中阳气是卵泡生长发育的动力;肾精充足和肾阴、肾阳的平衡与否,与卵巢储备功能、卵子发育成熟密切相关。因此,临床组方补肾精时,常加用仙茅-淫羊藿药对,使阴阳互助而泉源不竭,从而达到调整卵巢功能、促进内分泌水平恢复的效果。

仙茅-淫羊藿药对用于临床疗效确切,但其作用靶点和分子机制尚不清楚。网络药理学是多学科相互渗透,运用在线数据库及各项技术,揭示药物-基因-靶点-疾病相互作用的网络关系,通过网络关系预测药物的作用机制,用以寻找高效低毒药物的一门新兴学科[5]。临床上目前对于DOR的病因、病机、诊疗方案尚无规范化的认识,故本研究通过网络药理学的方法探讨仙茅-淫羊藿治疗DOR的作用机制,旨在为临床治疗DOR提供新思路。

1 研究方法

1.1 仙茅、淫羊藿相关靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw．com/tcmsp．php)检索仙茅、淫羊藿的化学成分,以口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件,获取活性成分及蛋白质靶点,在UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)中将化合物对应的蛋白质靶点进行统一标准化,将生物种类设定为“Homo sapiens”。

1.2 DOR相关靶点筛选 以“diminished ovarian reserve”为关键词进行搜索,挖掘人类基因注释数据库(GeneCards,https://www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://www.omim.org)、疾病相关的基因与突变位点数据库(DiSGeNET,http://www.disgenet.org)中DOR的相关靶点,合并疾病数据库靶点后去重,得到DOR的靶点信息,在UniProt蛋白质数据库中进行标准化。

1.3 仙茅、淫羊藿-DOR靶点PPI网络构建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将仙茅、淫羊藿活性成分作用靶点与DOR相关靶点取交集,并绘制韦恩图。将交集靶点提交至STRING 11.0数据库(https://string-db.org)并构建蛋白-蛋白交互(PPI)网络,将生物种类设定为“Homo sapiens”,最小互相作用阈值设定为“medium confidence”＞0.4,其余设置均为默认设置,得到PPI网络后通过Cytoscape 3.7.2对其进行分析,筛选关键靶点。

1.4 仙茅-淫羊藿与疾病交集靶点网络图构建 将1.3中获取的交集靶点与相对应的药物活性成分录入Cytoscape3.7.2,构建药物成分与靶点之间的网络图,根据网络拓扑学参数获得治疗DOR可能发挥药效的主要活性成分。

1.5 仙茅、淫羊藿-DOR关键靶点功能与通路的富集分析 将仙茅-淫羊藿药对治疗DOR的靶点录入Metascape数据库(http://metascape.org),物种信息选择为“H.sapiens”,对交集靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析,设置P＜0.01。

2 结果

2.1 仙茅-淫羊藿药对活性成分信息 经A DME属性筛选后共获得仙茅中的活性成分7种(剔除缺乏靶点信息成分MOL004146,余6种),淫羊藿中的活性成分23种,包括槲皮素(quercetin)、木犀草素(Luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等,见表1。仙茅作用靶点61个,淫羊藿作用靶点221个,合并去重后得到作用靶点228个。

表1 仙茅-淫羊藿药对活性成分信息

2.2 DOR靶点 从OMIM、GeneCards、DiSGeNET数据库中分别获取DOR靶点145、1 093、43个,将所得数据合并去重后进入UniProt数据库规范,选择生物种类“Homo sapiens”,最终得到1 138个DOR相关靶点。

2.3 仙茅、淫羊藿-DOR靶点PPI网络构建与分析 将筛选的仙茅-淫羊藿活性成分靶点与DOR疾病靶点通过Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集并绘制韦恩图。将获得128个交集靶点提交至STRING 11.0平台,得到仙茅、淫羊藿-DOR的靶点PPI网络。运用CytoScape 3.7.2进行可视化分析,该网络图包括128个节点与2 271条相互作用关系连线,节点大小与靶点蛋白的度值呈正相关。扫描题目右侧二维码查看图1—3。

2.4 仙茅-淫羊藿药对与疾病交集靶点网络图构建与分析 仙茅-淫羊藿药对与DOR交集靶点共128个,与其相关的药物活性成分是XM1、XM2、XM3、XM4、XM6、YYH5、YYH6、YYH8、YYH11、YYH21、YYH23。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。该网络包括141个节点,267条边,度值较高的活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇。扫描题目右侧二维码查看图4。

2.5 靶点功能与通路富集分析 仙茅-淫羊藿药对主要参与的生物信息学过程(BP)包括对有毒物质的反应(responsETo toxic substance)、对无机物质的反应(responsETo inorganic substance)、细胞对有机循环化合物的反应(cellular responsETo organic cyclic compound)、对脂多糖的反应(responsETo lipopolysaccharide)、对氧气水平的反应(responsETo oxygen levels)、血液循环(blood circulation)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)等。分子功能(MF)包括细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、蛋白质域特异性结合(protein domain specific binding)、G蛋白耦合胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、蛋白质激酶结合(protein kinase binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、核受体活性(nuclear receptor activity)等。细胞组成(CC)包括膜筏(membrane raft)、突触前膜的积分成分(integral component of presynapticmembrane)、囊腔(vesicle lumen)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)、蛋白激酶复合物(protein kinase complex)等。参与的富集通路主要有癌症途径、晚期糖基化产物-晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、细胞凋亡通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路扫描题目右侧二维码查看图4。

3 讨论

现代医学研究表明,仙茅-淫羊藿药对广泛用于治疗临床各科疾病,包括骨质疏松症、卵巢早衰、抑郁症等[5-7]。本研究结果显示,仙茅-淫羊藿药对治疗DOR的主要活性成分可能为槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇等,主要靶点可能为 AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3等,可能参与的通路有癌症途径、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、细胞凋亡、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等。由此可见,仙茅-淫羊藿药对治疗DOR是通过多成分、多靶点、多途径来达到治疗效果的。

槲皮素是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基及类雌激素样作用[8]。槲皮素既可改变卵巢内各级卵泡的比例及卵巢分化,又可抑制卵泡闭锁,影响相关激素的分泌,达到抑制卵泡发育的作用[9]。β-谷甾醇可作用于卵巢颗粒细胞,促进其产生雌二醇(E2),具有雌激素活性[10]。

蛋白激酶B(AKT1)是PI3K/AKT信号通路中重要的下游靶激酶,位于通路的核心位置,参与细胞生长的调控,当AKT1正常表达时,可以维持原始卵泡正常的生长发育,调节卵母细胞生长和颗粒细胞增殖分化,并可抑制细胞凋亡;当AKT1表达异常时,会使原始卵泡生长发育失常,导致卵巢发生病理性改变,加速卵巢衰老[11]。白细胞介素(IL-6)是一种多效性细胞因子,是PI3K/AKT通路的上游调控因子,参与人体免疫调节,且在卵泡闭锁中起着至关重要的作用[12]。有研究表明,IL-6等炎症因子是引起免疫性卵巢早衰的关键[13]。肿瘤相关蛋白TP53的一个同系物TAp63是脱氧核糖核酸(DNA)损伤凋亡通路的关键调控因子,当细胞DNA受损时,TAp63与磷酸化的非受体酪氨酸激酶c-Abl相互作用,激活下游信号分子促凋亡基因,诱发细胞凋亡级联反应,直接或间接促使卵巢储备功能降低[14]。TP53也与卵巢颗粒细胞的凋亡与增殖密切相关[15]。血管内皮生长因子A(VEGFA)是对血管形成具有特异性的重要作用因子,可通过促进内皮细胞的迁移及增殖促进血管新生[16]。卵泡的发育过程与血管新生密切相关,卵泡周围血管网络的发育障碍将导致卵泡颗粒细胞凋亡,进而导致卵泡闭锁。胱天蛋白酶3(CASP3)是胱天蛋白酶(CASP)家族中的一个凋亡效应因子,在卵母细胞、颗粒细胞中均有表达,主要参与细胞凋亡过程,当CASP3系统被激活时可触发细胞凋亡,加速卵巢早衰[17]。仙茅-淫羊藿药对可能通过调节以上主要靶点而发挥治疗DOR的作用。

PI3K/AKT是最重要的信号转导途径之一,参与细胞增殖、细胞周期调控、细胞凋亡和其他相关病理、生理过程[18]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和下游效应器蛋白激酶(AKT)属于一个保守的家庭信号转导酶,参与调节细胞的激活、炎性反应和细胞凋亡。卵母细胞中的PI3K信号能控制原始卵泡的存活、丢失和激活[19]。PI3K可以激活磷酸肌苷依赖激酶-1/2(PD K 1/2),然后磷酸化AKT的两个关键苏氨酸和丝氨酸残基。在卵巢中,AKT是PI3K/AKT通路中的重要激酶,并且在人类卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达。AKT具有广泛的底物,在卵泡激活过程中具有直接和间接的作用。原始卵泡激活支配着卵母细胞的生长发育及周围体细胞颗粒细胞的分化和增殖,因此这两个过程都是实现排卵的必要过程。此外,研究表明,该通路在免疫和自身免疫中发挥关键作用[20]。当超过10%的颗粒细胞出现凋亡时,卵泡可能处于闭锁状态,提示颗粒细胞凋亡是各发育阶段卵泡闭锁的主要机制。此外,颗粒细胞为卵母细胞成熟提供必要的生长信号和营养。颗粒细胞的状态对卵泡发育至关重要,其本质上是减少颗粒细胞凋亡,修复原始卵泡储备池,是修复卵巢功能的主要机制。PI3K/AKT通路参与代谢、细胞稳态、神经发育等过程,并调控细胞发育的各个方面,如凋亡、细胞周期和细胞分化。此外,PI3K/AKT通路参与卵母细胞生长、原始卵泡发育、颗粒细胞增殖和凋亡。研究发现,细胞毒性药物通过抑制PI3K/AKT信号通路,导致颗粒细胞凋亡,增加卵巢功能早衰发生的风险[21]。HIF-1是一种异源二聚体转录因子,由氧敏感亚基HIF-1 α和芳基烃核转位器HIF-1β组成。HIF-1的激活可以保护神经元免于凋亡,可以调节多种基因的表达。一方面,HIF-1可能通过抑制细胞色素C的释放、DNA修复酶PA R P的切割和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(CASPa Se)的激活来阻止凋亡细胞的死亡;另一方面,HIF-1可能通过抑制P53的激活来维持细胞生存。HIF-1激活后,葡萄糖运输和糖酵解流量的增加也与组织活力和细胞存活有关[22]。HIF-1通路中特定的转录因子被激活,可诱导卵巢中HIF-1 αm R NA和蛋白表达增加,并在颗粒细胞中进行特异性表达,表明HIF-1信号通路可能直接作用于卵巢,促进卵巢发挥其生理功能,从而防止卵巢早衰[23-24]。在卵泡的生长发育过程中,细胞凋亡起重要作用[25],颗粒细胞凋亡率过高影响卵母细胞发育,这可能是因为颗粒细胞向卵母细胞传递凋亡信息。NF-κB是体内最重要的核转录因子之一,参与多种基因调控、机体免疫应答和细胞凋亡的信号传导过程[26-27]。NF-κB对细胞凋亡存在双向调节,既可以促进细胞凋亡,也可以抑制细胞凋亡。由此可见,PI3K-AKT信号通路、细胞凋亡、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路对卵泡的调节起着至关重要的作用。

仙茅-淫羊藿药对是临床常用的补肾阳药对,本文基于网络药理学的方法,初步预测了此药对作用于DOR的基本药理学作用机制,为临床组方提供了新的思路。因数据库数据有限等客观原因,其具体作用机制仍需进一步研究来阐明。