赵 珊 王释婕 聂 晶 邵圣枝 吴 娇 赵冬香 高景林 袁玉伟,*

(1 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所， 海南 海口 571101； 2 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所/农业农村部农产品信息溯源重点实验室， 浙江 杭州 310021； 3 海南大学热带作物学院， 海南 海口 570000)

甜瓜(CucumismeloL.)是世界十大水果之一。国内外市场对甜瓜的品种、数量和质量等方面的要求越来越高，自80年代以来，甜瓜设施栽培迅速发展，并逐步走向产业化。设施环境的封闭性会导致外界昆虫无法进入，因此常使用氯吡脲(forchlorfenuron，CPPU)等人工合成生长调节剂或其他化学辅助授粉技术促进坐果，然而此类方法容易产生安全隐患并影响果实品质。近年来，蜜蜂授粉已在设施甜瓜中广泛应用，蜜蜂授粉的甜瓜果肉中蔗糖含量和香味物质显著增加，食用品质明显优于使用氯吡脲处理的甜瓜[1-2]。

植物的稳定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)具有“自然指纹”的属性，可随生长环境发生变化，能够反映植物生长过程中的环境因素差异[3-5]。植物的δ13C值可以反映植物生长、光合作用和气孔特性[6]，δ15N值主要受土壤环境和人工施肥的影响[7-8]，δ18O值和δ2H值主要受环境中水循环、纬度、气温和海拔等影响[9]。目前稳定同位素分析已广泛应用于农产品产地溯源、真实性判别和有机食品鉴别[10-11]，如茶叶[7，12]、大米[13]、小麦[14]、苹果[15-16]、杨梅[17]、葡萄酒[18]等产地溯源，果汁[19]、蜂蜜[20-21]等掺假鉴定，鸡蛋[22]、有机蔬菜[23]等有机食品鉴别以及设施栽培[24]和施肥方式[25]判别等。已有研究表明，植物中同位素的变化受气候生态、植物生理代谢和栽培方式等的影响，然而有关设施条件下激素坐果和蜜蜂授粉对甜瓜中同位素组成影响与发育期变化等的相关研究却鲜见报道。

本研究通过测定不同发育期设施甜瓜中4种稳定同位素比值(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)，比较激素授粉和蜜蜂授粉甜瓜中稳定同位素的特征差异，旨在探究设施甜瓜稳定同位素的变化规律，丰富稳定同位素的溯源与鉴别理论，为农产品产地溯源与鉴别以及同位素数据库的构建与完善提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验于2018年12月至2019年2月在海南省乐东黎族自治县甜瓜(金香玉)设施棚内进行。土壤类型为滨海沙地，设施简易棚为钢架结构，吊蔓立体栽培，拱棚间过道和外围用防虫网密封，选择健康，生长状态一致的植株进行试验。

氯吡脲，四川施特优化工有限公司；咯菌腈，先正达南通作物保护有限公司；δ13C的参照标准为VPDB，δ15N的参照标准为Air，δ18O和δ2H的参照标准为VSMOW，均购自国际原子能机构(International Atomic Energy Agency，IAEA，奥地利)。

1.2 主要仪器与设备

Elementarvario PYRO cube元素分析仪-同位素比率质谱(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers，EA-IRMS)、vario PYRO cube元素分析仪，德国Elementar公司；Isoprime 100同位素质谱仪，英国Isoprime公司；XP6 电子天平，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；FDY1001-UV-P 超纯水仪，青岛富勒姆科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 甜瓜开花授粉时，在同一设施棚内同时进行激素授粉和蜜蜂授粉试验，在同一种植区共选择3个设施棚进行试验。激素授粉处理组：将10袋5 mL氯吡脲(有效成分0.1%)和2袋10 mL咯菌腈(有效成分25 g·L-1)加入1 L水中混合后，快速均匀地喷洒在雌花子房(瓜胎)上，再用网袋套住，并做好标记；蜜蜂授粉处理组：在雌花开放前一天的夜间，将中华蜜蜂授粉蜂群(3张脾/箱，有蜂王)搬至设施棚内，第二天标记中华蜜蜂访问的雌花。

选取授粉后第7、第10、第20、第30天以及采收期(第45～第47天)的甜瓜果实进行同位素比率值测定。每个处理组随机选取5个甜瓜，3个设施棚共计150个样本。将不同发育期的甜瓜去皮去籽，果肉切碎后匀浆，匀浆后将样本在-80℃条件下冷冻干燥72 h，检测稳定同位素前于干燥器中平衡3 d。

1.3.2 碳、氮稳定同位素测定 参照刘志等[26]的方法，采用元素分析仪-同位素比率质谱测定甜瓜果肉中的总δ13C和δ15N值。称取约2 mg甜瓜样品，用锡箔杯包样后，通过自动进样器进入元素分析仪中，样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2和N2，再经稀释后进入同位素质谱仪检测。具体参数为：元素分析仪氧化炉和还原炉的温度分别为920和600℃，N2吹扫流量为250 mL·min-1，同位素质谱检测时间设置为550 s，以CO2和N2为参考气。

1.3.3 氧、氢同位素测定 参照刘志等[26]的方法，采用元素分析仪-同位素比率质谱测定甜瓜样品中的δ18O和δ2H值。称取约1 mg甜瓜样品，用银箔杯包好后放入120位自动进样器内，将样品送入元素分析仪中，经燃烧炉高温裂解后，产生的CO和H2进入同位素质谱仪进行检测。具体参数为：N2流量为125 mL·min-1，燃烧炉温度为1 450℃，同位素质谱检测时间设置为950 s，O2和H2作参考气。

1.3.4 稳定同位素比率计算 按照公式计算稳定同位素比率：

δ=[(R样品/R标准)-1]×1 000‰

式中，R样品为所测样品中重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为标准样品中重同位素与轻同位素的丰度比，其中δ13C的相对标准为VPDB，δ15N的相对标准为Air，δ18O和δ2H的相对标准为VSMOW。

1.4 数据处理

各处理数据平等测定3次，采用SPSS 24软件对试验数据进行单因素方差分析和Spearman相关性分析，结果以Mean±SD表示，并采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同发育期及授粉方式对设施甜瓜δ13C值的影响

单因素方差分析箱线图可以更全面、直观地反映不同授粉方式甜瓜在不同发育期样本间的差异。由图1可知，激素授粉甜瓜在不同发育期的δ13C值不同，且甜瓜发育10 d时的均值与采收期(45～47 d)存在显著差异(P<0.05)，整个发育期蜜蜂授粉对甜瓜的δ13C值无显著影响(P>0.05)。在甜瓜发育30 d时，2种授粉方式的δ13C值差异最大，蜜蜂授粉的δ13C均值高于激素授粉1.033‰(图1)。对δ13C值的变异系数进行分析，发现在2种授粉方式下，随着发育时间的延长(7～30 d)，甜瓜δ13C值的变异系数绝对值由大到小，在采收期时出现反弹(表1)。

表1 不同授粉方式设施甜瓜不同发育期果实中δ13C、δ15N、δ18O和δ2H值的变异系数Table 1 Coefficient variances in δ13C, δ15N, δ18O and δ2H values of greenhouse muskmelon during the different development stages by different pollination methods /%

注：不同小字母表示差异显著(P<0.05)。“∘”表示均值。下同。Note：Different lowercase letters represent significant difference at 0.05 level.‘∘’ represents the average value.The same as following.图1 不同授粉方式设施甜瓜果实发育期δ13C值的单因素方差分析箱线图Fig.1 One-way ANOVA boxplot of δ13C value in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.2 不同发育期及授粉方式对设施甜瓜δ15N值的影响

由图2可知，随着发育期的变化，激素授粉对不同发育期甜瓜的δ15N值均无显著影响，而蜜蜂授粉甜瓜在第7和20天的δ15N值差异显著(P<0.05)。在甜瓜发育20 d时，2种授粉方式的δ15N值差异最大，激素授粉甜瓜δ15N均值较蜜蜂授粉高1.13‰，激素授粉甜瓜δ15N值的变异系数小于蜜蜂授粉，此外发育7 d时激素授粉甜瓜的δ15N值差异最大，变异系数为0.61%(表1)。

图2 不同授粉方式设施甜瓜果实发育期δ15N值的单因素方差分析箱线图Fig.2 One-way ANOVA boxplot of δ15N value in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.3 不同发育期及授粉方式对设施甜瓜δ18O值的影响

由图3可知，激素授粉对不同发育期甜瓜δ18O值的影响较小(P>0.05)。发育7和30 d的δ18O值存在显著差异(P<0.05)。在甜瓜采收期时，2种不同授粉方式的δ18O值差异最大，蜜蜂授粉δ18O高于激素授粉1.85‰。通过对δ18O值的变异系数进行分析，发现随发育期的变化，2种授粉方式甜瓜δ18O值的变异系数差异较小。此外，在采收期时，激素授粉甜瓜的δ18O值与δ15N值呈极显著正相关(P<0.01)(表2)；在发育10 d时，蜜蜂授粉甜瓜的δ18O值与δ15N值呈极显著正相关(P<0.01)(表3)。

图3 不同授粉方式设施甜瓜果实发育期δ18O值的单因素方差分析箱线图Fig.3 One-way ANOVA boxplot of δ18O in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.4 不同发育期及授粉方式对设施甜瓜δ2H值的影响

由图4可知，在发育7～20 d时，2种授粉方式对甜瓜的δ2H值无显著影响(P>0.05)；而在发育30 d时，蜜蜂授粉和激素授粉甜瓜的δ2H值出现显著差异(P<0.05)，分别为-53.50‰和-43.63‰。这可能是由于甜瓜受代谢过程中同位素分馏的影响，导致接受不同授粉方式甜瓜的δ2H值出现差异。通过对δ2H值的变异系数进行分析，发现2种授粉方式甜瓜δ2H值的变异系数在采收期时差异最大(表1)。对同一发育期甜瓜的δ2H值与其他同位素比率进行相关性分析(表2、表3)发现，在发育10 d时，激素授粉甜瓜的δ2H值与δ18O值呈极显著负相关(P<0.01)，而蜜蜂授粉甜瓜的δ2H值与δ18O值、δ15N值均呈极显著正相关(P<0.01)；对于激素授粉而言，甜瓜在发育20 d时δ2H值与δ18O值呈极显著正相关(P<0.01)，采收期甜瓜的δ2H值与δ13C值、δ18O值均呈极显著正相关(P<0.01)。说明蜜蜂授粉甜瓜发育10 d时δ2H和δ18O、δ15N值的变化趋势一致，激素授粉甜瓜发育20 d时δ2H和δ18O的变化趋势一致。

图4 不同授粉方式设施甜瓜果实发育期δ2H值的单因素方差分析箱线图Fig.4 One-way ANOVA boxplot of δ2H in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

3 讨论

蜜蜂授粉可降低生产成本，提升果品品质。目前国内外针对不同授粉方式对果品同位素影响的基础性研究较少，无法区别蜜蜂授粉与其他授粉的差异。本研究结果表明，在相同种植和环境条件下，激素授粉和蜜蜂授粉设施甜瓜的δ13C、δ15N和δ18O值都无显著差异，可能由于授粉方式对同一发育期碳、氮和氧的同位素分馏效应无明显影响，不足以作为区别甜瓜授粉方式的有效特征指标。然而，2种授粉方式的甜瓜在不同生长时期，碳、氮和氧稳定同位素存在自然分馏效应和差异变化，这些差异可能是由于植物在不同发育期光合碳代谢途径[26-27]、养分的积累和分配[27-28]等不同。如植物中δ13C值的范围因光合作用的途径不同而存在差异，因此能够反应植物的生长方式和生理生态过程；氧同位素受植物的光合作用以及呼吸作用中的同位素分馏影响；农产品中氮同位素的影响主要与农业施肥相关。

对于δ2H值，生物体代谢方式的不同也可能引起合成碳水化合物分子同位素组成的差异，造成2H/1H比率的变化。植物干物质中的氢同位素不仅受降水同位素的影响，也受植物蒸腾作用的影响[18]。在果树生长过程中，水分运输到植株各部位时并未出现分馏现象，但后续进行一系列生化反应后产生了同位素的分馏，导致δ2H值发生变化[29]。本研究发现，在发育30 d时激素授粉和蜜蜂授粉甜瓜的δ2H值呈显著差异，这说明δ2H值可能受授粉方式的影响。由此可见，δ2H值可作为设施甜瓜不同授粉方式鉴别的一个重要指标，但不同授粉方式引起δ2H值出现差异的机理需要进一步深入研究。此外，水果中特征成分含量还受其他因素(如品种、成熟度)的影响，因此用单一变量作为判定甜瓜授粉方式真实性溯源指标，存在一定的局限性，推测还需要结合多元素、有机成分分析[13]等结果支撑，才能更好地进行果品溯源分析。

4 结论

本研究通过EA-IRMS比较了不同发育期设施甜瓜中4种稳定同位素比值(δ13C、δ15N、δ18O和δ2H)。结果表明，在同一发育时期，不同授粉方式甜瓜果实中的δ13C、δ15N和δ18O值较稳定，无显著差异(P>0.05)，仅发现在甜瓜发育30 d时蜜蜂授粉和激素授粉δ2H值存在显著差异，可作为甜瓜授粉方式的一项标识性指标。该研究初步揭示了不同授粉方式下和发育阶段中甜瓜稳定同位素的变化特征和影响规律，对丰富设施甜瓜溯源体系具有重要意义。但由于本研究选取在海南省种植的甜瓜样品进行试验，具有一定的地域限制，试验结果的普遍性不足。因此，今后将针对在不同生产区域、地域相近、品种相似的甜瓜进行更深入的分馏机理研究，建立并完善甜瓜果品的安全溯源体系。