管俊娇 杨龙 木万福 杨晓洪 张鹏 黄清梅 张建华

（1 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明 650205；2 云南省农业科学院热区生态农业研究所，云南元谋 651399；3 云南省农业科学院粮食作物研究所，云南昆明 650205）

青花菜（Brassica oleraceaL.var.italicaPlenck）又名绿色花椰菜、西兰花、绿菜花等，是起源于欧洲地中海沿岸的甘蓝类蔬菜变种。因其具有较高的营养价值和防癌抗癌功效，近年来成为深受人们喜欢的健康食品，需求量和种植面积逐年增加。中国已成为青花菜重要的生产国，种植面积接近全球的30%，但生产用种主要依赖进口。虽然国内育种家们经过多年努力选育出了一些优良青花菜新品种，但是目前生产中青花菜用种90%以上仍然为进口，种子价格昂贵。随着对品种和种子需求的急剧增加，种子市场中的“多、乱、杂”现象，“同种异名”“同名异种”“假冒套牌”等现象频发，对青花菜产业的良性健康循环发展极为不利。加之农作物品种管理和种子质量管理技术滞后，造成了种子生产、质量和市场管理混乱，使国家和农民利益受到重大损害，也重挫了育种家的创新力。亟需建立一套快速、准确可靠、操作简便的品种鉴定识别技术，为青花菜品种管理提供技术支撑，为非主要农作物商品种子进口监管提供技术支持。

DNA 指纹图谱不受环境条件的影响，可以从分子水平上对品种的遗传特异性进行快速、准确地鉴定，被认为是品种鉴定最简单、有效的方法（高源 等，2015）。而分子身份证则是在得到DNA 指纹图谱的基础上，运用不同的编码方式对指纹图谱进行数字化处理后得到字符串，能够更加简单明了地区分种质资源，计算机自动比对种质资源差异，克服人工比对的繁琐、低效等问题（陈昌文等，2011；徐雷锋 等，2014）。在众多的分子检测技术中，SSR 标记因具有多态性高、重复性好、共显性遗传和易于检测等优点（王凤格 等，2014），被植物品种保护联盟（UPOV）推荐为农作物品种鉴定和构建指纹数据库的方法之一（滕海涛 等，2009）。目前已开展了水稻（陆徐忠 等，2014）、玉米（王凤格 等，2017）、大豆（李清 等，2020）、苹果（高源 等，2015；李慧峰 等，2020）、甘蓝型油菜（马琳 等，2013）、梨（张靖国 等，2014）、萝卜（邱杨 等，2014）等作物分子身份证的研究工作，这些研究对农作物品种资源评价、利用和保护等起到了重要作用。

本试验以青花菜22 个主要栽培品种为试材，筛选最佳引物组合，采用荧光SSR 分子标记技术建立品种指纹图谱，构建各栽培品种独有的、可辨的条形码鉴定标识即分子身份证，以期用最简引物组合实现品种的最大程度区分，减少繁复的工作量和高昂的检测成本，为青花菜品种的快速识别提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取在国内分布面积较大的青花菜栽培品种22 个，均为一代杂种，其中国内自主知识产权品种3 个，进口品种19 个（表1）。2020 年8月在云南省农业科学院热区生态农业研究所基地种植，苗期取幼嫩叶片，-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取 每品种混合取20 个单株的叶片，采用改良的CTAB 法（Porebski et al.，1997）提取DNA。

1.2.2 SSR 引物筛选 依据前人研究公布的甘蓝类SSR 遗传标记（Li et al.，2013；王庆彪 等，2014；张志仙 等，2017；刘春晴 等，2018；Zhu et al.，2018；林晖 等，2019；盛小光 等，2019；褚云霞等，2020），经过初筛，在每条染色体上均匀选择1～3 对，共22 对SSR 荧光标记引物（表2）用于遗传多样性检测。PCR 反应体系（10 μL）包括：2× mix 混合液5 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，样品DNA 1 μL，超纯水3.4 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物及试剂均由上海挚科生物有限公司提供。扩增产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA 分析仪（Applied Biosystems，USA）上检测。利用GeneMapper Ver.3.7 软件（Applied Biosystems，USA）对原始数据进行统计和校正，读出每个样品各位点的等位变异扩增片段大小数据。

表2 22 对SSR 引物信息

1.2.3 品种身份证的构建 采用PowerMarker V3.25 软件计算引物的多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）和基因多样性（gene diversity，D），以及Nei’s 遗传距离并按非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。对引物进行二次筛选，筛选出鉴别青花菜品种的核心引物，读取22 个青花菜品种的核心SSR荧光标记的指纹数据，并对指纹数据进行数字化编码。编码中扩增信息标注方式依据扩增位点分子量从小到大的顺序记录各检测位点的分子量（略去单位bp，只记录数字），如果1 个品种经同一引物扩增同时检测出多个位点，则用“-”连接数字，即可简单表示每个品种的扩增信息。再结合品种的基本信息，利用二维码生成软件将编码字符串转化成每个品种独特的条码标识，即分子身份证。

评估引物多态性高低的指标采用多态性信息含量（PIC）和基因多样性（D）。

式中，Pi和Pj分别代表第i个和第j个等位基因的频率，且i≠j。

式中，Plu代表第l个基因位点第u个等位基因的频率。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

22 对SSR 引物扩增产物经荧光毛细管电泳检测后，每对引物在每份样品中均可获得精确的DNA 片段。22 对引物在22 份样品中共扩增出60 个等位基因，平均每对引物扩增出2.7 个，60 个等位基因共组成了73 个基因型。其中，引物BoGMS1004、BoE718、BoGMS0941 扩增出的等位基因数目最多（5.0 个）；而引物BoE450、HCSSR1、Na10D03 只扩增出1 个条带，不具备多态性。基因多样性的变异范围为0～0.7，平均为0.4；多态性信息含量（PIC）的变异范围为0～0.7，平均为0.4，其中在BoGMS0941、BoE723、BoE718、BoGMS1119 等位点所检测到的PIC 值较大（表3）。

表3 22 对SSR 引物在青花菜中检测到的遗传多样性信息

2.2 最佳引物组合筛选

分子身份证的构建既要满足唯一性和可识别（鉴别）性，又要同时满足最简引物组合的要求，否则将会造成构建的分子身份证冗繁。基因型数、多态性信息含量高的引物鉴别力较强。根据这些原则对22 对引物进行筛选优化，删除鉴定性差的等位基因位点，选择基因型数、多态性信息含量高的引物。

使用1 对SSR 引物难以将22 个青花菜品种全部区分开，选取多态性较高的引物BoGMS0941、BoE718、BoE723、BoGMS1119、BoGMS1004、BoGMS0501 两两组合，分析其对参试品种的区分率。BoGMS0941 和BoE718 引物组合分辨率最高，可以区分11 个品种；其次是BoE718 和BoGMS1004 引物组合，可以区分10 个品种；再次是BoGMS0501 和BoGMS1119 引物组合，可以区分9 个品种。根据2 对引物组合的区分结果，继续增加引物组合的数量。在增加到4 对引物时，可以将全部青花菜品种区分开来，这4 对引物为BoGMS0941、BoE723、BoE718、BoGMS0501。

2.3 聚类分析

根据22 个青花菜品种的Nei’s 遗传距离（表4），利用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。通过遗传距离进行聚类可以将22 个品种全部区分开来，其中耐寒优秀与MKS-1307 遗传距离最大，达到了1.00；其次是雅翠91 与云青花18115、女神、喜鹊、贝绿美，强汉与贝绿美、蝴蝶，遗传距离为0.88；而翡翠11号与雅翠91，云青花18115 与绿辉7号，17-2305 与锦翠2号，锦翠2号与美青的Nei’s 遗传距离最小，为0.07。聚类结果表明（图1），22 个青花菜品种在遗传距离为0.30 处被分为两大分支，第一分支包括耐寒优秀、美青、翡翠11号等9 个品种，第二分支包括冷翠、女神、三月鲜等13 个品种。

表4 22 个青花菜品种的Nei’s 遗传距离矩阵

2.4 品种身份证编码

利用筛选出的4 对核心引物构建22 个青花菜品种的分子指纹图谱，图2 为美青在4 个SSR 位点的分子指纹图谱。读取22 个青花菜品种的4 个SSR 荧光标记的指纹数据（表5），按标记所在染色体由小到大排序，即按照BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723 的顺序依次排列。例如，美青的扩增产物在毛细管荧光电泳系统检测得到的片段大小（bp）为249/249、175/224、209/222、179/179（青花菜为二倍体，SSR 扩增只有1 条主带时，须重复记录1 次）。

表5 22 个青花菜品种的分子指纹信息

按顺序排列4 对引物的扩增片段大小作为品种的分子指纹信息，再加上青花菜品种的基本商品信息，包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、生产经营者名称，最后利用二维码技术将每个品种按相同顺序排列的字符串转化成其唯一的二维码标识，即分子身份证。美青的二维码分子身份证如图3-a 所示，扫码后内容如图3-b所示。

3 结论与讨论

3.1 青花菜品种鉴别引物筛选

SSR 分子标记作为稳定、高效且多态性好的品种鉴定方法，被广泛应用于作物的鉴评研究中。本试验利用筛选出的22 对SSR 引物对22 个青花菜品种的遗传多样性进行了研究，共检测到60 个等位位点，平均每对引物扩增出2.7 个等位位点，22对引物的多态性信息含量（PIC）在0～0.7 之间，平均为0.4。在前人的研究中，张志仙等（2017）利用14 对引物在28 份青花菜材料中共扩增出94个条带，平均每对引物扩增出6.71 条，多态信息量为0.20～0.91，遗传相似系数在0.585 1～0.904 3之间，平均遗传相似系数为0.728 9。储云霞等（2020）采用36 对引物在110 个青花菜和63 个花椰菜品种中共扩增出269 个多态性位点，每对引物的多态性条带数在2～17 个之间，平均7.47 个。相比较而言，由于本试验采用的青花菜品种为目前市场主推品种，育种过程降低了变种内的遗传多样性水平，引物的多态性较低。构建种质的分子身份证，要求用最少的引物数量区分最多的种质（高源 等，2015）。因此，依据引物对品种的区分率、引物扩增等位基因数量和多态性信息含量，由高到低，从1 对引物开始，逐步增加引物组合的数量，直至获得能够鉴别全部品种的引物组合，达到使用最少的引物可以区分最多的品种的目的。本试验中，筛选出的4 对核心引物组合就可将参试的22 个青花菜品种进行区分，随着需要鉴别的品种数量增加，现有引物无法全部区分时，可增加其他引物进行鉴定和构建品种分子身份证。

3.2 分子身份证构建分析

DNA 指纹图谱是快速鉴别植物品种的有效工具。DNA 指纹图谱构建采用的方法有特征引物法、单引物法和核心引物组合法（蒋林峰 等，2014）。但特征引物法需要获取不同品种的特异性等位基因，需要对现有的品种进行大量的引物筛选，大大降低了鉴定效率。本试验采用4 对SSR 引物组合构建了22 个青花菜品种的分子指纹图谱，之后将分子指纹数据及相关品种信息导入二维码生成器，成功构建数字化的22 份青花菜分子身份证。将所得到的数据转化为可视化的信息，检索该品种时更加方便且全面。本试验构建的品种分子身份证二维码可以通过制作标签，标识于商品种子包装上，直接用于优良品种种子的防伪和溯源，使用者可用读码器获得品种信息，对规范种子市场管理具有促进作用。