张圆 林祎 吴琼 刘政海 李彩 何洁

1（南华大学衡阳医学院肿瘤研究所肿瘤细胞和分子病理学湖南省重点实验室 衡阳 421001）

2（南华大学应用解剖与生殖研究所 衡阳 421001）

3（海南省热带脑科学研究与转化重点实验室 海口 571199）

放射疗法是治疗原发性和继发性脑肿瘤的有效方法之一［1］。然而，随着颅脑肿瘤发病率及确诊率的增加，各种放疗技术和影像检查手段的迅速发展与广泛应用，放射治疗所致并发症的发病率也呈上升趋势［2］。头部辐照后诱发的认知功能障碍是整个或部分脑部放疗的常见并发症，出现学习、记忆、空间信息处理等海马依赖性功能的缺陷，严重影响患者远期生活质量［3］。中枢神经系统损伤反应的关键参与者之一的小胶质细胞占脑实质内细胞总数的10%～15%，其影响大脑发育，维持神经元生存环境，对损伤进行应答和修复［4-5］。同时，小胶质细胞激活后释放出的炎性因子可介导神经元损伤，破坏中枢神经系统稳态，在多种神经系统疾病发生、发展过程中扮演重要角色［6］。小胶质细胞通过经典途径被激活，经历M1极化并分泌大量活性氧和有害介质，例如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO），可促进中枢神经系统炎症反应并加速神经元死亡。在神经炎症后期，通过替代激活途径极化为M2 表型的小胶质细胞可以分泌精氨酸酶-1（Arg-1）、白介素-10（IL-10）和其他抗炎症因子，这将减弱由于过度炎症反应造成的突触损伤，并促进轴突的再生［7-8］。小胶质细胞的功能与其形态变化密切相关，然而在头部辐射所致认知障碍过程中，脑内小胶质细胞的形态学变化往往被忽视。受周围环境的影响，小胶质细胞呈现多种表型。在稳定状态下，小胶质细胞是由多个分支和突起组成的分叉细胞，能覆盖很长的距离并监测大脑的功能状态；在压力或病理状况，小胶质细胞从分叉状变形为变形虫形状［9-10］。然而，以往对小胶质细胞活化后形态改变缺少定量研究。Sholl Analysis以细胞胞体为圆心，画一系列同心圆，得到随离胞体距离变化的突起交点（Intersections）个数，以此来反映细胞的复杂性，进而定量分析小胶质细胞形态变化的分析方法［11］。因此，进一步研究小胶质细胞在头部电离辐射所致认知障碍小鼠海马内的形态变化，有助于进一步理解小胶质细胞的功能。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

离子钙结合衔接分子1 （Ionized calcium binding adaptor molecule-1， IBA-1）单克隆抗体（Abcam， ab5076）； 生物素化兔抗羊抗体（CWBIO，CW0107）；兔血清（武汉博士德，AR0010）；ABC试剂盒（Vector，PK-4000）；DAB显色试剂盒（中山金桥，ZLI-9019）；三羟甲基氨基甲烷（北京博奥拓达科技公司）；甘氨酸（北京博奥拓达科技公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo公司）；PCR 试剂盒（日本TAKARA 公司）；Triton X-100（美国Sigma 公司）。西门子ONCOR型直线加速器（德国SIEMENS公司）；BX-51型光学显微镜（日本Nikon 仪器公司）；YZ90000 型旷场装置（上海永州实验设备公司）；ABI7500 型荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）。

1.2 动物分组与辐照条件

将购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司动物（动物合格证号：2019-0004）的8 周龄雄性ICR 小鼠（体重35～40 g） 随机分为对照组（Control）和头部辐照组（Irradiation，IR），每组9 只。采用6 mV 高能X 射线头部局部辐照至吸收剂量10 Gy，构建放射性认知功能障碍模型，剂量率3 Gy/min。对照组在相同的辐照环境下，不辐照。

1.3 新旧事物识别实验

利用小鼠对新鲜的事物表现出更强的探索欲望及好奇心的原理，以检测小鼠区分新旧事物的能力，从而反映小鼠认知功能。辐照后56 d 进行新旧事物识别实验，检测小鼠认知功能。实验分为训练阶段和测试阶段。训练阶段：放置两个形状、质地相同的物体于旷场对称位置处，小鼠由旷场正中放入，进行5 min物体识别训练，然后取出小鼠，用75%乙醇擦拭实验装置。测试阶段：在训练结束1 h后，将旷场内的其中一个物体更换为另一质地、形状颜色完全不同的新物体，但两物体在旷场中的位置仍然保持不变，再次将小鼠由旷场正中放入，让其自由探索5 min，并通过连接到自动跟踪系统（上海欣软信息技术有限公司SuperMaze）的摄像机记录其5 min 内对两物体的总探索时间。按公式（1）计算新事物识别指数，该指标越高代表小鼠记忆能力越好。

1.4 新旧位置识别实验

新旧位置识别实验被广泛用于检测小鼠海马依赖性的空间记忆能力。辐照后56 d 进行新旧位置识别实验。试验分为训练阶段和测试阶段。训练阶段：将两个形状、质地完全相同的物体成对角线位置放置在旷场装置中，将小鼠由旷场正中放入，让小鼠自由探索，5 min 后取出小鼠，用75%乙醇擦拭实验装置。测试阶段：间隔1 h后更换旷场中一个物体位置，另一个物体位置保持不变。使用连接有自动跟踪系统（上海欣软信息技术有限公司SuperMaze）的摄像机记录其5 min 内对两个位置上物体的总探索时间。按公式（2）计算新位置识别指数，该指标越高代表小鼠记忆能力越好。

1.5 免疫组织化学染色

实验方法参照文献［12］。10%水合氯醛（10mg/kg）腹腔注射，依次采用生理盐水和4%多聚甲醛进行心脏灌注固定，取脑置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h。经15%和30%蔗糖溶液梯度脱水处理。进行冠状连续冷冻切片，片厚30 μm。磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10 min×3 次，后续实验皆用此法进行漂洗。3%H₂O₂浸泡28 min，漂洗；5%的兔血清室温封闭2 h 后，加入羊抗IBA-1 多克隆抗体（1：1 000），室温下孵育2 h 后于4 ℃过夜；次日复温1 h，漂洗；生物素化兔抗山羊IgG二抗（1：1 000）室温孵育2 h，漂洗；加入提前配好的三抗（AB 液，1：200，Vector 公司）中孵育2 h，漂洗；最后进行DAB 染色，贴片，晾干，依次经75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脱水、100%二甲苯脱脂及中性树脂胶封片。光学显微镜下统计海马DG区IBA-1阳性细胞数。

1.6 RT-PCR

实验方法参照文献［13］。使用10%水合氯醛（10 mg/kg）麻醉后，分离小鼠大脑，分离海马并冷冻在-80°C。根据Trizol®试剂（CWBIO）说明书提取总RNA。RNA 纯度通过A260nm/A280nm吸收比确定。使用RevertAidTM First Strand cDNA合成试剂盒（Fermentas）将1 μg总RNA进行cDNA合成。并将cDNA 存储在-20 ℃。采用TAKARA 试剂盒进行操作，采用2-ΔΔCt法对基因的表达水平进行相对定量分析。GAPDH基因表达用作内部对照。使用两步PCR方案，PCR循环条件如下：在95°C下30 s 进行预变性，然后在95 °C 下10 s 和60 °C 下30 s进行40个循环的PCR反应。引物设计见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Target sequences of PCR

1.7 Sholl analysis分析

实验方法参照文献［14］。使用奥林巴斯（Olympus）显微镜（奥林巴斯，日本）和zven2.6.blue 软件拍摄40×（物镜）照片。图像以2 464×2 056 像素密度拍摄。然后在imageJ 中导入图像并处理，自动提取背景，然后随机裁剪每个图像，从每个图像中提取一个具有代表性的300 dpi样本，并将每个图像转换为8-bit，然后进行细胞骨架化处理进行Sholl分析，每只小鼠分析18～20个细胞。

1.8 统计学分析

采用Graph Pad Prism 6.0 软件进行统计学分析并绘图，实验数据以xˉ±s表示，实验数据采用两组之间比较，采用t检验，p＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 头部辐照对小鼠认知功能的影响

2.1.1 新旧事物识别实验检测小鼠认知功能

按流程图1（a）所示，采用剂量率为3 Gy/min、能量为6 MV 的X 射线进行单次10 Gy 头部辐照，构建头部辐射所致认知功能障碍模型，并在辐照后56 d 用新旧事物识别实验和新旧位置识别实验来检测小鼠认知功能。图1（b）为新旧事物识别实验中小鼠活动轨迹图。如图1（c）所示，与对照组（25.770±4.347）相比，头部辐照组（3.447±3.801）小鼠新事物时间辨别指数明显降低（p＜0.01），差异有统计学意义。头部辐照组小鼠对新事物的辨别指数降低，表明头部辐照小鼠出现认知功能障碍。

图1 头部辐照对小鼠新旧事物识别实验的影响：（a）实验流程图；（b）小鼠活动轨迹图；（c）头部辐照对小鼠新事物时间辨别指数影响；**p＜0.01，与对照组相比Fig.1 Effects of head irradiation on the novelty object recognition test in mice:(a)the experimental flowchart;(b)the movement trajectory diagram of mice;(c)the discrimination ratio in the Novelty object recognition test;**p ＜0.01 vs.control group

2.1.2 新旧位置识别实验检测小鼠认知功能

辐照后56 d 进行新旧位置识别实验，结果如图2 所示，与对照组（18.500±5.970）相比，头部辐照组（-6.161±5.796）小鼠新位置时间辨别指数明显降低（p＜0.05），差异有统计学意义。头部辐照组小鼠对新位置的辨别指数降低，表明头部辐照小鼠出现认知功能障碍。

图2 头部辐照对小鼠新旧位置识别实验的影响：（a）小鼠活动轨迹图；（b）头部辐照对小鼠新位置时间辨别指数影响；*p＜0.05，与对照组相比Fig.2 Effects of head irradiation on the Novelty Place Recognition test in mice:(a)the movement trajectory diagram of mice;(b)the discrimination ratio in the Novelty Place Recognition test;*p＜0.05 vs.control group

2.2 头部辐照对小鼠海马小胶质细胞标记物IBA-1表达的影响

头部辐照后小鼠海马齿状回区（DG区）IBA-1免疫组化结果如图3 所示。相比于对照组（16.270±1.428），头部辐照组（25.430±3.670）海马IBA-1 标记的阳性细胞数明显增加（p＜0.05），说明头部辐照增加了小鼠海DG 区IBA-1阳性细胞数目。

图3 头部辐照对小鼠海马DG区小胶质细胞表达的影响：（a）小鼠海马DG区IBA-1免疫组化染色结果，A和C为对照组，B和D为头部辐照组；（b）海马DG区IBA-1阳性细胞统计学结果；*p＜0.05，与对照组相比较Fig.3 Effects of head irradiation on IBA-1 positive cells in the DG of hippocampus:(a)the results of IBA-1 immunohistochemistry images,A and C are control group;B and D are 10 Gy-IR group;(b)the numbers of IBA-1 positive cells in the hippocampal DG of mice statistical analysis for each group;*p＜0.05 vs.control group

2.3 头部辐照对小鼠海马DG区小胶质细胞形态的影响

如图4（a）所示，根据随机取样原则，对各组小鼠海马DG 区小胶质细胞进行Sholl analysis 分析，定量分析小胶质细胞形态改变情况。两因素方差分析显示，如图4（b）所示，与对照组（1～90 μm）相比，头部辐照组（1～70 μm）小鼠海马DG区小胶质细胞突起变短；且在70～80 μm，与对照组小鼠相比，头部辐照组小鼠的小胶质细胞突起与同心圆上的交叉点个数减少（p＜0.05），说明头部辐照后小鼠海马DG区小胶质细胞形态复杂性降低。

图4 头部辐照对小鼠海马DG区小胶质细胞形态变化的影响：（a）Sholl analysis分析小鼠海马DG区小胶质细胞形态示意图；（b）小胶质细胞形态分析统计结果；*p＜0.05，与对照组相比较Fig.4 Effects of head irradiation on morphological change of IBA-1 positive cells in the DG of hippocampus:(a)result of Sholl analysis of morphological cells in the DG of hippocampus morphology;(b)morphological analysis of microglia;*p＜0.05 vs.control group

2.4 头部辐照对小鼠海马M1/M2 型小胶质细胞标记物mRNA表达的影响

t检验分析如图5 所示，与对照组（1.000±0.087）相比，头部辐照组（1.539±0.191）小鼠海马M1 型小胶质细胞标记物CD68 mRNA 的表达上调（p＜0.05）。与对照组（1.000±0.131）相比，头部辐照组（0.427±0.049）小鼠海马M2型小胶质细胞标记物ARG1 mRNA的表达下调（p＜0.001）。

图5 头部辐照对小鼠海马M1/M2型小胶质细胞标记物mRNA表达的影响；*p＜0.05，***p＜0.001，与对照组相比较Fig.5 Effects of head irradiation on the mRNA expression of M1/M2 microglia markers in the hippocampus of mice;*p＜0.05,***p＜0.001 vs.control group

3 讨论

头部辐照所致认知障碍是多数接受局部或全脑放疗癌症患者的一个不可忽视的晚期并发症，严重影响着这些患者的远期生活质量［15］，但其具体机制尚不明确。头部辐照所致认知障碍的发生发展与许多因素有关，除了与颅脑肿瘤等疾病本身进展状况相关，同时也与放射治疗的一些辐射参数（如吸收剂量大小、辐射能量、剂量率等）相关［16］。在动物实验中，有研究发现，使用单次10 Gy 的X 射线头部辐照后2 个月，用Morris 水迷宫检测小鼠认知功能，小鼠表现出明显的认知功能障碍［17］。因此，本研究采用剂量率为3 Gy/min、能量为6 MV 的X 射线进行单次10 Gy 头部辐照，构建头部辐射所致认知功能障碍模型，并在辐照后56 d 用新旧事物识别实验和新旧位置识别实验来检测小鼠认知功能。结果显示：头部辐照组小鼠对新事物或新位置的辨别指数降低，头部辐照所致认知障碍模型建立成功。

作为对电离辐射敏感的靶细胞之一，小胶质细胞在辐射所致认知障碍的发生和转归中的重要意义不可忽视［18］。相关研究显示，过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）能通过负调节活化B细胞κ轻链增强子的核因子（NF-κB）途径和激活蛋白-1（AP-1）途径来抑制辐射诱导的小胶质细胞炎症反应从而减轻辐射引起的认知损害［19］。通过给予辐照后小鼠喂养含集落刺激因子-1 受体（CSF1R）抑制剂PLX5622 的食物，来减少照射后的小胶质细胞数目，能使小鼠认知功能改善［20］。本研究通过免疫组织化学法检测到头部辐照小鼠海马小胶质细胞标记物IBA-1阳性细胞数的表达增加，与文献报道一致［21］。众所周知，小胶质细胞的功能和形态变化是密不可分的，小胶质细胞能快速响应大脑生理或病理变化进而发生相应形态学改变［22］。在生理条件下，成熟的小胶质细胞呈胞体小、分枝精细且长的形态，从而使它们能够筛查脑实质中是否有入侵的病原体或损害。病理条件下，小胶质细胞从高度分支状迅速转变为阿米巴样细胞型，这使它们能迅速迁移至受损部位吞噬细胞碎片或细菌等。因此，小胶质细胞形态变化作为反应大脑功能状态正常与否的指标，引起人们广泛关注。2018 年，Young 等［23］发表了一篇用Sholl analysis分析小胶质细胞形态的文章，表明小胶质细胞形态（如细胞分支数目、细胞分支长度、分支点数目等）可以被量化为连续变量，为小胶质细胞形态学的研究提供定量分析手段。Wadhwa 等［24］发现使用咖啡因和莫达非尼不仅能通过抑制小胶质细胞激活，改善大鼠睡眠剥夺时的神经炎症和焦虑行为，同时用Sholl analysis分析小胶质细胞形态，发现使用咖啡因/莫达非尼能改善由于睡眠剥夺所致大鼠小胶质细胞突起变短、分支数减少等形态变化。过往关于辐射所致认知障碍的相关研究中人们主要关注小胶质细胞所介导的神经炎症、神经元凋亡或神经元死亡等功能变化，相对忽视脑内小胶质细胞的形态变化，且对小胶质细胞活化后形态改变缺少定量研究。本研究通过Sholl analysis 分析小鼠海马DG 区小胶质细胞形态，结果表明，头部辐照小鼠海马DG区小胶质细胞突起变短；小胶质细胞突起与同心圆的交叉点个数减少，小胶质细胞形态复杂性降低。

越来越多的研究证实，在中枢神经系统中小胶质细胞激活存在异质性，可分为两种相反的类型：促炎性M1 型和免疫抑制性M2 型。小胶质细胞暴露于促炎细胞因子γ 干扰素（IFN-γ）、TNF-α和细菌或细胞碎片后会朝着促炎（M1）表型极化，表达高水平的诱导型一氧化氮（iNOS）促进一氧化氮（NO）产生，介导中枢神经系统炎症反应并加速神经元死亡。小胶质细胞通过替代途径激活后朝着抑炎（M2）表型极化，该状态诱导抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子β（Tgfb）、Arg1的表达，在过敏反应、寄生虫清除、炎症抑制、组织重塑、血管生成和免疫调节等方面发挥着重要作用［25］。不同表型的小胶质细胞起着损伤和保护的双重作用。脊髓损伤相关研究表明，在脊髓损伤早期阶段小胶质细胞以M2 型为主，而在损伤的后期主要为M1 型，仅小部分是M2型。缺氧预处理条件下，间充质干细胞释放的外泌体miR-216a-5p 可通过抑制Toll 样受体4（TLR 4）的活性，使小胶质细胞从M1 向M2 表型转移，从而调节TLR4/NF-κB/PI3K/AKT 信号级联，促进脊髓损伤后小鼠的功能恢复［26］。然而，在辐射所致认知障碍过程中，小胶质细胞M1/M2表型变化尚不明确，本研究通过RT-PCR 检测发现，头部辐照小鼠海马小胶质M1 型标记物CD68 mRNA 表达上调，M2 型标记物Arg1 mRNA 表达下调，结合Sholl 分析结果提示，在辐射所致认知障碍过程中，活化小胶质细胞向M1 型（促炎表型）极化，我们推测头部X 射线照射致认知障碍可能与小鼠海马小胶质细胞形态变化及小胶质细胞向M1型极化相关。

4 结论

采用X 射线单次头部辐照至吸收剂量10 Gy，建立头部辐射所致认知障碍模型，以模拟临床颅内肿瘤患者长期多次放射治疗所致认知障碍。与对照组相比，头部辐照组小鼠新事物时间辨别指数和新位置时间辨别指数均明显降低；海马区IBA1 阳性细胞数明显增加；小胶质细胞体变大，突起回缩，树突分支数与同心圆交点数目减少，海马M1型小胶质细胞标记物CD68表达上调，M2型小胶质细胞标记物Arg1 表达下调。综上，我们得出结论：头部X 射线照射致认知障碍可能与小鼠海马小胶质细胞形态变化及小胶质细胞向M1型极化相关。