忙顺兰，罗晓蔓，丁贵杰

（1.贵州大学 a.贵州省森林资源与环境研究中心；b.贵州省高原山地林木培育重点实验室；c.林学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省林业调查规划院，贵州 贵阳 550003）

马尾松Pinus massoniana是我国全树综合利用程度高的乡土乔木针叶树种，具有分布广、面积和蓄积大、生长快、产量高、抗性强等特性，在荒山造林和工业用材等方面被广泛应用[1]。马尾松还是典型外生菌根真菌树种，其特有的哈氏网、外延菌丝、菌丝套等形态结构与根系形成共生体[2]，拓宽根系与土壤接触的面积、提高植物营养物质的吸收、增强植物抵御环境胁迫潜力[3]。真菌定植于根系后形成的菌根能够改变植物根系的细胞结构、膜透性和代谢功能，进而影响根系分泌物的化学成分和数量[4-5]。

根系分泌物是植物在生长过程中通过根系向根际土壤释放的糖类、氨基酸类、有机酸类等有机物质统称[6]。它不仅是植物与土壤进行物质交换和信息传递的重要载体，也是调节土壤微环境活力与功能的关键因素[7]。到目前为止，有学者对根系分泌物对土壤性质的影响做了大量研究工作。例如，耿贵[8]发现大豆根系分泌物抑制土壤酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性，提高脲酶和蔗糖酶活性，而玉米根系分泌物对土壤酶活性具有活化效应。袁秀梅等[9]发现低量和高量蚕豆根系分泌物降低土壤pH 值和碱解氮含量，但显著增加土壤中有效磷、钾含量。唐颖[10]发现落叶树根系分泌物中碳刺激胞外酶产生，促进根际土壤氮素的转化及有效性。由此可见，不同植物根系分泌物及其浓度对土壤酶活性及养分含量的影响存在显著差异。

近年来，有学者针对菌根化马尾松苗木形态变化(如生长状况、根系形态等)、生理响应(如光合作用、酶活性、养分循环等)和菌根苗胁迫等方面[11-12]做了大量工作，但尚未对接菌后马尾松根系分泌物在土壤中的作用进行研究。因此，本试验选用接菌/不接菌马尾松幼苗根系分泌物，以不同浓度浇灌于马尾松幼苗土壤，研究土壤酶活性和养分含量的变化规律，旨在为马尾松菌根育苗、马尾松人工林可持续利用及马尾松林地肥力管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌种：由西南大学资源环境学院黄建国教授供给的两种菌株褐环乳牛肝菌Suillus luteus(简称Sl)，记为Sl13 和Sl12。选取Pachlewski 培养基对上述菌种进行培养和扩繁。

马尾松种子：采自贵州都匀马寨马尾松国家良种基地。

栽植基质：黄壤土，理化性质：pH 值为5.30，有机质含量为76.83 g·kg-1，全量养分氮磷钾含量依次为0.78、0.74、11.50 g·kg-1，速效养分氮磷钾含量依次为47.80、80.00、40.00 mg·kg-1。

1.2 试验方法

1.2.1 接菌/不接菌马尾松苗培育

种子处理：将清水洗好的种子用5‰高锰酸钾溶液进行消毒后冲洗，温水浸泡，置于恒温箱催芽，等到种子露白时播种。

土壤处理：用5‰高锰酸钾溶液消毒杀菌，盖上塑料薄膜，通风晾晒一周。

接菌和播种：试验在苗圃大棚中展开，采用条播方式。将已处理的土壤铺成苗床，分别喷洒两种菌剂(Sl13 和Sl12)，再播上露白种子，覆土。不接菌(NS)则喷洒等量无菌培养液。培养1 a 后提取根系分泌物。

1.2.2 根系分泌物的提取及溶液配制

根际土采集：选取规格一致的1年生马尾松苗(其中Sl13、Sl12、NS 平均侵染率依次为85.90%、84.9%、2.84%)，从苗床上掘起，轻抖根系，把附在细根表面不脱落用灭菌刷刷落的土作为根际土，各处理均取200 g，装入灭菌自封袋中，于4℃保存，待试验用。

根系分泌物提取：采用乙醇浸提法[13]，在其基础上进行改进。具体为：将各处理根际土分别装入锥形瓶中，按1∶2 的体积比加入85%的乙醇，置于28℃恒温摇床中振荡24 h；再置于高速离心仪(转速：3500 r·min-1，温度：4℃)中离心20 min，取过滤上清液；置于真空旋转蒸发仪脱去乙醇浸提剂，乙酸乙酯萃取1 次；再分别用浓度均为1 mol·L-1的盐酸和氢氧化钠调节溶液pH 值为酸性和碱性，等量乙酸乙酯萃取；合并中、酸、碱性乙酸乙酯相，即为马尾松根系分泌物提取液。

浓度配制：将上述提取液置于真空旋转蒸发仪旋转浓缩，无水硫酸钠脱水，因部分根系分泌物难溶于水，需取1 mL 乙醇溶解，配制浓度为1 mg·mL-1的根系分泌物溶液( 每mL 蒸馏水含1 mg 根系分泌物)，并将其稀释为0.5、0.25 mg·mL-1两个浓度，即得到Sl13、Sl12、NS马尾松高、中、低3 个浓度水平的根系分泌物，另取1%乙醇溶液作为对照CK。

1.2.3 试验设计

试验在苗圃大棚中进行，于2016年3月，将长势一致的1年生幼苗移栽至盆(25 cm×20 cm)中，每盆种植3 株，每个浓度3 盆，共30 盆，缓苗后开展试验。每周分别向盆内浇灌不同浓度根系分泌物溶液300 mL，4 个月后采集土样，测定土壤酶活性和土壤养分。

1.2.4 指标测定

土壤酶活性测定使用北京索莱宝生物科学技术有限公司的试剂盒，测定步骤和结果计算均参照说明书进行，其中多酚氧化酶、脲酶、酸性磷酸酶依次采用邻苯三酚比色法、靛蓝比色法、磷酸苯二钠比色法。土壤化学性质均参照国家行业标准的相关方法测定[14]，包含：pH 值、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷、速效钾。

1.2.5 数据处理

使用Excel 2010 软件对采集的数据进行统计及簇状柱形图和三线表制作，采用PASW Statistics 18.0 进行单因素方差分析和Duncan 法显著性检验。

2 结果与分析

2.1 接菌/不接菌马尾松根系分泌物对土壤酶活性的影响

3 种土壤酶对接菌/不接菌马尾松根系分泌响应不同(图1)。多酚氧化酶：接菌处理除高浓度外均表现为促进作用，不接菌处理影响不大，甚至略呈抑制作用，但处理间均差异不显著(P＞0.05)。脲酶：高浓度(1 mg·mL-1) 下，Sl12 较CK 显著增加了20.64%；中浓度(0.5 mg·mL-1)下，Sl13、Sl12、NS 较CK 分别增加了22.47%、22.47%、11.15%，Sl13 和Sl12 与CK 差异显著(P＜0.05)，NS 与CK 差异不显著(P＞0.05)；低浓度(0.25 mg·mL-1)下，Sl13 较CK 显著增加了26.71%。酸性磷酸酶：与CK 相比，Sl13、Sl12、NS 依次提高了11.10%、9.32%、6.98%(1 mg·mL-1)，9.51%、6.04%、0.34%(0.5 mg·mL-1)，其中高浓度下Sl13与CK 差异显著(P＜0.05)，低浓度下接菌/不接菌马尾松根系分泌物表现为抑制作用，但差异不显著(P＞0.05)。

图1 不同马尾松幼苗根系分泌物对土壤酶活性的影响Fig.1 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlings on soil enzyme the activities

2.2 接菌/不接菌马尾松根系分泌物对土壤pH值和全量养分的影响

接菌/不接菌马尾松幼苗根系分泌物对土壤pH 值和土壤全量养分影响程度有所区别(表1)。高、中浓度(0.5～1 mg·mL-1)下，与CK 相比，Sl13、Sl12、NS 的pH 值变化幅度为：-6.76%～-4.02%、-1.65%～-0.91%、0.18%～2.38%；土壤有机质和全氮、全磷、全钾的变化规律性不明显，且处理间差异不显著。低浓度(0.25 mg·mL-1)下，与CK 相比，Sl13、Sl12、NS 处理有机质提高了10.51%、0.77%、6.05%，Sl13 与CK 差异显著(P＜0.05)，3 种根系分泌物均促进全氮、全磷、全钾含量的积累，且接菌马尾松根系分泌物的促进作用较不接菌强，处理间差异不显著(P＞0.05)。

表1 不同马尾松幼苗根系分泌物对土壤pH 值和土壤全量养分的影响†Table 1 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlingson soil pH and total nutrients

2.3 接菌/不接菌马尾松根系分泌物对土壤有效养分的影响

如图2可知，接菌/不接菌马尾松根系分泌物对土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量的影响不明显，差异不显著(P＞0.05)。

图2 不同马尾松幼苗根系分泌物对土壤有效养分的影响Fig.2 Effects of root exudates of different Pinus massoniana seedlings on soil available nutrients

2.4 施加根系分泌物后的土壤酶活性与土壤养分相关性分析

由表2可知，多酚氧化酶与有机质、全氮、有效磷相关系数分别为0.700、0.704、0.657，呈显著正相关(P＜0.05)；与全磷、碱解氮、速效钾相关系数分别为：0.808、0825、0.835，呈极显著正相关(P＜0.01)。脲酶与速效钾相关系数为0.645，呈显著正相关(P＜0.05)。酸性磷酸酶与pH 值和有效磷呈密切正相关(相关系数分别为：0.665，P＜0.05；0.769，P＜0.01)。由此说明在根系分泌物的作用下，土壤酶与土壤养分共同影响土壤肥力。

表2 施加根系分泌物后的土壤酶活性与土壤养分相关性分析†Table 2 Correlation analysis of soil enzyme activities and nutrients after applying root

3 讨 论

土壤酶是土壤生化过程的动力，其活性大小可反映土壤肥力、质量、环境的演化情况[15]。研究表明，真菌与植物形成共生关系后，根系分泌物中游离氨基酸、可溶性蛋白、可溶性糖等低分子量化合物含量明显增多[16-17]，丰富土壤微生物的营养物质，促进土壤中某些细菌、放线菌和真菌的繁殖和生长[18-19]，进而增加了土壤酶的来源[20]。本研究中，接菌马尾松根系分泌物对脲酶和酸性磷酸酶有一定的活化作用，对多酚氧化酶的作用效果不明显；不接菌马尾松根系分泌物对3 种土壤酶的影响未达统计学意义。这与陈莉莎[21]研究结果有一定区别，原因可能是不同植物根系分泌的物质成分和含量存在差异。

土壤中有机质、氮、磷和钾含量的高低表征土壤养分及肥力状况[22]。根系分泌物能够通过多种途径降解土壤中碳和磷等难溶性物质，促进土壤养分积累，增强土壤供肥能力[23-24]。本研究发现，接菌马尾松根系分泌物降低土壤pH 值，不接菌提高土壤pH 值，这与罗晓蔓等[25]研究结果一致，接菌植物根系分泌物含量和成分增多，尤其是甲酸、乙酸、草酸等酸类物质，使土壤pH 值下降；其次接菌马尾松根系分泌物中可能含有携带羧基等酸性的粘胶，释放H+离子，降低土壤pH值[26]。本研究中，盆栽马尾松幼苗土壤受到低浓度(0.25 mg·mL-1)接菌根系分泌物作用后，土壤有机质含量明显升高，而不接菌根系分泌物处理的土壤有机质变化不大，这可能在于真菌与寄主形成的共生体改变了根系分泌物特性，这种改变诱导土壤难溶性碳受到络合作用及降解反应等打破有机矿质复合体的稳定性，将保护性碳释放出来，增加有机质含量[27]；土壤氮磷钾养分含量对接菌和不接菌马尾松根系分泌物无明显响应，但接菌根系分泌物对氮磷钾养分的影响幅度更大，这在于接菌马尾松根系分泌物降低土壤酸碱度，加重原生矿物的酸化程度降低其稳定性，增强氮磷钾等矿物质的溶解释放，增大土壤氮磷钾含量的变化幅度。本试验结果与孙磊等[28]研究有所不同，可能与供体植物根系分泌物、土壤类型和受体植物等因素有关。

相关研究显示，土壤酶和土壤养分相关性较强[29-30]。本研究中，多酚氧化酶活性与有机质、全量养分氮磷、有效养分氮磷钾含量存在较强的正相关性，脲酶活性与有效钾含量存在较强的正相关性，酸性磷酸酶活性与pH 值和有效磷含量存在较强的正相关性。说明土壤酶通过酶促作用改变土壤中化学物质存在形式，土壤化学性质对土壤酶作出反馈调节，协同修饰土壤质量。这与前人的研究结论相似。易艳灵等[31]用柏木根系分泌物处理盆栽香椿土壤后发现，土壤酶活性增强，有效养分含量也得到提高。魏圣钊等[32]发现，受连载巨桉根系分泌物影响的土壤理化性质改变土壤酶活性，提高土壤肥力。由此可知，土壤酶活性和土壤养分相辅相成，土壤养分循环和土壤有效养分供给力的强弱离不开土壤一系列酶的酶促作用，酶促反应也离不开作为基础底物的土壤理化性质，二者共同影响土壤肥力。

马尾松根系分泌物对土壤质量的影响是一个复杂的过程。本研究比较了3 个浓度水平下的接菌马尾松分泌物和不接菌马尾松根系分泌物处理后土壤多酚氧化酶、脲酶、酸性磷酸酶活性，及土壤酸碱度、有机质、总氮磷钾量和速效氮磷钾量含量的差异，并分析了施加马尾松根系分泌后土壤酶活性与土壤养分两者之间相关紧密程度，对于马尾松菌根苗的培育和马尾松人工林林地肥力的调控具有一定的指导意义。但是仅仅掌握土壤酶活性及土壤养分变化规律尚不能完全调控土壤肥力，还需深入研究根系分泌物处理后土壤微生物种类和数量的分布情况及变化趋势。通过研究这些指标，系统掌握根系分泌物在土壤养分循环和转化的作用机制，进而科学管理林地肥力，提高林地土壤生产力。此外，目前关于季节性动态监测林木根系分泌物-土壤-微生物互馈机制及林木根系分泌物调节林地碳动态变化机理的研究尚未见到报道[33]，未来森林培育工作应加强上述研究，厚实林木根系分泌物与土壤生态环境相互关系理论知识，为林业发展提供更好的服务。

4 结 论

接菌马尾松根系分泌物影响土壤酶活性。从数值上来看，中、低浓度下，接菌Sl13 和Sl12 使多酚氧化酶活性增大，不接菌则减小；高、中浓度下，3 种根系分泌物脲酶活性和酸性磷酸酶活性均增大，但接菌根系分泌物作用幅度更大。从显著性来看，高浓度下接菌Sl12、中浓度下接菌Sl13 和Sl12、低浓度下接菌Sl13 的脲酶活性显著增强，高浓度下接菌Sl13 显著提高酸性磷酸酶活性，不接菌处理对土壤酶无显著影响。

接菌马尾松根系分泌物使土壤pH 值下降，不接菌根系分泌物使土壤pH 值升高。接菌马尾松根系分泌物Sl13 在低浓度下显著促进土壤有机质含量的积累。接菌/不接菌马尾松根系分泌物对土壤全氮、全磷、全钾、有效氮、有效磷、速效钾的影响不明显。但从数值上来看，接菌马尾松根系分泌物在高低浓度下的全氮、全钾、全磷含量比不接菌根系分泌物高。

土壤多酚氧化酶与土壤有机质、全氮、有效磷，土壤脲酶与土壤速效钾，土壤酸性磷酸酶与土壤pH 均呈显著正相关；土壤多酚氧化酶与土壤全磷、碱解氮、速效钾，土壤酸性磷酸酶与土壤有效磷均呈极显著正相关。

综上所述，接菌马尾松根系分泌物激活土壤脲酶活性和酸性磷酸酶活性，降低土壤pH 值，提高土壤有机质含量，对土壤多酚氧化酶活性和土壤氮磷钾含量的影响未达统计学意义。不接菌马尾松根系分泌物提高土壤pH 值，对土壤酶和土壤养分的影响较小。对盆栽马尾松幼苗土壤施加接菌/不接菌马尾松根系分泌物后，土壤酶与土壤养分存在显著或极显著相关性。表明接菌马尾松根系分泌物对土壤肥力的影响程度较不接菌马尾松根系分泌物大，在接菌马尾松根系分泌物的作用下，土壤酶和土壤理化性质协同改善土壤质量。