谭 磊，陈明月，沈 彬

南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166

CRISPR⁃Cas系统是细菌、古细菌对抗病毒进化出来的免疫机制，2012 年，首次将CRISPR⁃Cas9 系统成功应用于大肠杆菌基因组编辑［1］，随后这一系统被广泛应用到哺乳动物和人类细胞中［2］，从此基因编辑进入了新时代。目前已知的绝大部分疾病是由碱基突变导致的，为了构建疾病模型或者修复致病突变，基于CRISPR⁃Cas9 系统的碱基编辑器应运而生，可以实现A·T 到G·C 和C·G 到T·A 的突变，最近出现的先导编辑器（Prime editors）可实现12种单碱基的任意替换、短片段的删除和插入［3］。虽然CRISPR⁃Cas9 技术日趋完善，但将其广泛应用于临床基因治疗还存在一定的风险，其在特异性、安全性和在体转导方面仍有待提升。

1 CRISPR⁃Cas9系统的特异性

野生型SpCas9 存在严重的脱靶效应［4］，为了降低这一系统的脱靶活性，多个研究团队对其进行了优化。利用Cas9切口酶和双sgRNA［5］，或者利用失活Cas9融合Fok1和双sgRNA 都可以显著降低脱靶［6］。对sgRNA 的改造也可用来增加特异性，比如截短sgRNA（Truncated sgRNA）［7］和发卡sgRNA（haripin⁃sgRNA）［8］等。基于Cas9 蛋白结构进行优化可以在降低脱靶效应同时保持较高的编辑活性。Slay⁃maker 等［9］通过丙氨酸扫描技术，开发了eSpCas9（1.1），这种Cas9 变体降低了Cas9 与非互补链DNA的亲和力。利用类似的原理，Kleinstiver 等［10］开发了高保真突变体SpCas9⁃HF1。Chen 等［11］利用eSp⁃Cas9（1.1）和SpCas9⁃HF1 在与非靶向序列结合时会转换成非活跃状态的机制对野生型Cas9 进行氨基酸突变，获得了兼具高切割活性和低脱靶活性的HypaCas9。Casini 等［12］在酵母上对Rec3 结构域突变的SpCas9 文库进行筛选，鉴定出了四重突变体evoCas9，尽管这一突变体特异性很高，但也极大地降低了编辑活性。……