张 旭，陈 阳，严 霞，史晓凤，马 君

(中国海洋大学青岛市光学光电子重点实验室，山东 青岛 266100)

果蔬农药残留是食品安全一直存在且不可忽视的问题。倍硫磷是一种兼有接触和内吸性的广谱、速效的杀虫剂。多菌灵是一种广谱性杀菌剂，对皮肤和眼睛有刺激，经口中毒出现头昏、恶心、呕吐。这两种农药也是果蔬中常用的杀虫剂和杀菌剂，也是容易残留和超标的农药。超标的农药残留对人和动物危害极大[1]，还会造成环境污染[2]。目前国内外农药残留的检测方法主要包括理化检测法(色谱检测技术及其联用技术等)[3-4]和生物检测技术(生物传感器、酶联免疫测定法、生物芯片等)[5]。这些方法各自存在不同的优缺点而被局限于不同的检测领域。

表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一种与粗糙金属材料(如金、银等)相关的表面增强效应，可使拉曼信号增强约1014～1015倍。因其灵敏度高、信息含量丰富，作为一种独立的检测手段被用于各方面的检测中[6-7]。近年来，SERS技术也被广泛用于农药残留的检测。2013年杜一平小组[8]应用GMA-EDMA多孔材料结合快速高灵敏SERS检测方法，对两种农药三环唑和百草枯的最低检测浓度为5×10-3和1×10-3mg/L。2014年，Zhu Yiqun等[9]通过银镜反应制备了基于滤纸上沉积银纳米粒子(Ag NPs)的实用SERS基底，快速、便携和准确地鉴定和检测了果蔬表皮的福美双和对氧磷农药残留。2014年，Li Xiaozhou等[10]采用SERS技术检测苹果皮中磷酸盐和倍硫磷的农药残留，检测极限分别为0.05和0.4 mg/L。2015年，Ma Chunhua等[11]应用SERS技术检测茶叶中的多菌灵，SERS峰强和多菌灵浓度的线性范围为0.5～8.0 mg/kg，检测限为0.1 mg/kg，另外，研究发现茶叶上多菌灵的半衰期为4 d。2017年Chen Zhai等[12]应用SERS技术检测苹果样品中啶虫脒、毒死蜱和多菌灵的混合农药，它们的最低可检测浓度分别为0.005 4，0.064和0.014 mg/kg。

目前，果蔬表皮农药残留的快速、高灵敏度的现场检测技术仍是研究的关键问题。本文以苹果为例，以果蔬表皮常见的两种农药——杀虫剂倍硫磷和杀菌剂多菌灵为研究对象，应用GMA-EDMA多孔材料结合金纳米颗粒制备的纳米检测棒，快速、无损检测果蔬表皮两种农药，探究两种农药残留在果蔬表皮的衰减规律，并对日常生活中常用的清洗方式的效果进行了比对研究。

1 实验

1.1 实验仪器和材料

实验仪器：Ocean Optics 公司的便携式QE65000系列拉曼光谱仪，分辨率为6 cm-1，光谱范围0～1 800 cm-1；上海熙隆光电科技有限公司生产的FC-785-500-MM型窄线宽半导体激光器，激发波长为785 nm，激光器耦合入光纤的功率可调，最大为500 mW；InPhotonics公司生产的785 nm RPB型号的Y形反射式光纤探头；日立集团的S4800扫描电子显微镜。

实验试剂：柠檬酸三钠、氯金酸(HAuCl4· 4H20)、甲醇、乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司，倍硫磷、多菌灵购于阿拉丁试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

实验样品：从市场购买的新鲜富士苹果。

1.2 样品的制备

倍硫磷与多菌灵均难溶于水，配制标准液时，先用乙醇配制成0.1 g/L的标准液，再用超纯水稀释成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0和6.0 mg/L等不同浓度备用。购置的苹果先用清水充分冲洗，再用超纯水冲洗，自然晾干后，用记号笔在苹果表面标记出1 cm2的区域，分别取200 μL不同浓度的倍硫磷、多菌灵溶液滴加到不同的标记区域内，放置在阴凉通风处，自然晾干待用。

1.3 纳米检测棒的制备

纳米检测棒分为两部分：金纳米颗粒直接涂于待测苹果表面，吸附残留农药，滴加微量NaCl使金纳米颗粒聚集；多孔材料再将金纳米颗粒吸附于表面，由于毛细作用，该多孔材料具有良好的吸水性，在检测苹果表皮农药残留时，可以将探测物吸附在多孔材料表面，并直接在其表面进行SERS探测，使SERS探测更加方便、灵敏度更高。

金纳米颗粒的制备参考Frens法[13]，以柠檬酸钠作为还原剂加热还原氯金酸，制备好的金纳米颗粒呈紫红色，冷却待用。

GMA-EDMA多孔材料的制备参考Frantisek Svec的方法[14-15]，通过原位聚合反应得到GMA-EDMA多孔材料。制备过程如下，首先将单体GMA、交联剂EDMA、制孔剂环己醇和十二醇按一定体积比(VGMA∶VEDMA∶V环己醇∶V十二醇为15∶15∶49∶21)混合，再加入一定量的AIBN作为热引发剂，AIBN占GMA与EDMA混合物质量比的1.15%，将混合溶液充分混匀。将适量混合溶液加入到容量为5 mL的塑料模具中，通氮气以充分排空混合溶液以及模具中的氧气，迅速将模具密封并置入恒温箱中65 ℃下反应12 h。反应完成后，分别以10倍柱体积无水乙醇和10倍柱体积超纯水冲洗残留制孔剂，最终得到的GMA-EDMA多孔材料为白色柱状固体，存储备用。

1.4 苹果表皮农药的SERS探测

应用纳米检测棒检测苹果表皮农药残留过程如图1所示，取100 μL金纳米颗粒均匀滴加在苹果表皮标记区域内，覆盖整个标记区域，静置1 min使表面农药与金纳米颗粒充分吸附，滴加微量NaCl溶液使吸附了农药的金纳米颗粒聚集，随后用GMA-EDMA多孔材料将混合溶液吸附在其表面进行SERS探测。作为对照，苹果表皮无农药残留区域的SERS光谱也通过相同的实验方法获得。

图1 苹果表皮农药残留快速检测示意图

探测倍硫磷时到达样品表面的激光功率30 mW，积分时间10 s；由于多菌灵在温度高于215 ℃时升华，探测多菌灵时到达样品表面的激光功率10 mW，积分时间15 s，分别在样品表面5个不同位置采集光谱，每个位置采集5次。并用Origin软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 纳米检测棒的增强效果

2.1.1 增强效果 通过扫描电子显微镜对纳米检测棒进行表征(见图2)。金纳米颗粒的平均粒径为57 nm 左右。多孔材料的孔结构由小颗粒连接形成的微孔以及团簇之间的大孔组成，大孔主要起传质作用，能有效降低柱压，微孔可以将金纳米颗粒固定在三维表面，且形成合适的间距，促使更多“热点”的形成[8]，有效的提高SERS灵敏度。

图2 纳米检测棒扫描电镜图

以1 mg/L的多菌灵为探针分子，对比纳米检测棒和金纳米颗粒的增强效果(见图3)。滴加微量NaCl溶液于金纳米颗粒与农药的混合溶液中，SERS信号有了一个数量级以上的提高(见图3中b和c)；再以纳米检测棒吸附一定量上述混合溶液，SERS信号进一步增强约15倍(见图3中a和b)。产生增强的原因为NaCl溶液的加入改变了金纳米颗粒的聚集状态，使得纳米颗粒间距变小，“热点”效应更强；纳米检测棒中的GMA-EDMA多孔材料表面具有丰富的三维孔结构，可以使金纳米颗粒聚集在多孔材料表面，金纳米颗粒一方面进一步提高了聚集状态，另一方面形成三维结构，从而形成更多的“热点”。该纳米检测棒可以大幅提高仅以金纳米颗粒为基底的增强效果，而且可以使SERS探测更加方便、灵敏度更高，可以用于苹果表皮农药残留的检测。

(a：纳米检测棒，b：金纳米颗粒+NaCl溶液，c: 金纳米颗粒，d：空白。 a: Detection stick, b: Gold NPs+NaCl solution, c: Gold NPs, d: Blank.)

2.1.2 检测灵敏度 进一步验证纳米检测棒的最低检测浓度，利用纳米检测棒检测倍硫磷和多菌灵各浓度标准溶液的SERS谱，结果见图4(a)和图5(a)。

表1为倍硫磷和多菌灵SERS峰位及其振动模式归属[10-11]，这些特征峰可以作为两种农药的“指纹”谱，在实际检测中可以作为能否检测出两种农药的依据。

图4(b)以倍硫磷的1 048和1 220 cm-1处的特征峰强度与溶液浓度做关系曲线，随着浓度的增加，特征峰强度也在增加，浓度高于1.0 mg/L时，峰强随浓度增加趋于缓慢，低于0.05 mg/L检测不到信号，在低浓度(0.05～1.0 mg/L)范围内对拉曼峰强与浓度的关系做线性拟合，有良好的线性关系，线性回归决定系数R2均为0.99。

表1 倍硫磷和多菌灵SERS峰归属

图4 不同浓度倍硫磷SERS谱及拟合曲线

以纳米检测棒为基底检测多菌灵各浓度SERS谱，以630和1 218 cm-1处的特征峰强度与溶液浓度做关系曲线(见图5(b))。随着浓度的增加，特征峰强度也在增加，浓度高于0.50 mg/L时，峰强随浓度增加趋于缓慢，低于0.05 mg/L时检测不到特征峰信号，在低浓度(0.05～0.50 mg/L)范围内对拉曼峰强与浓度的关系做线性拟合，有良好的线性关系，线性回归决定系数R2均为0.99。

结果表明以纳米检测棒为基底对倍硫磷和多菌灵的最低检测浓度可达0.05 mg/L，且在低浓度范围内峰强与浓度均有良好的线性关系，可以为农药残留定量检测提供一种定量模型。该纳米检测棒灵敏度高，同时可以定量检测农药残留，能够用于苹果表皮农药残留的检测。

2.2 苹果表皮农药残留量的SERS检测结果

取滴加了不同浓度农药的苹果样品，分别用纳米检测棒直接在苹果表面进行检测。滴加了不同浓度倍硫磷苹果的检测结果如图6所示。苹果表皮倍硫磷SERS谱中，浓度低至0.1 mg/L时，仍可以探测到1 048和1 220 cm-1处的SERS信号，低于0.1 mg/L检测不到SERS信号，分别对特征峰强与浓度进行线性回归，分析可得，倍硫磷在苹果表皮残留的最低检测浓度为0.1 mg/L，在0.1～2.0 mg/L的浓度范围内拉曼峰强与浓度有良好的线性关系，可用于苹果表面倍硫磷农药残留定量分析的依据。

图5 不同浓度多菌灵SERS谱及拟合曲线

苹果表皮多菌灵的SERS谱见图7。在浓度为0.05 mg/L时，630、1 262 cm-1处的特征峰依然可见。低于0.05 mg/L时检测不到特征峰信号，拉曼特征峰强与浓度的关系，在低浓度范围内(0.05～0.5 mg/L)，浓度与峰强成线性关系，倍硫磷和多菌灵在苹果表皮残留浓度与峰强拟合曲线如表2所示。 在苹果表皮检测到的农药的浓度范围与标准液检测结果存在差异，主要原因是苹果表皮的吸收以及农药干燥过程中的蒸发。

图6 苹果表皮倍硫磷SERS谱及拟合曲线

应用SERS技术，结合实验室制备的检测棒，可以实现苹果表面农药残留的快速、高灵敏并且无损的检测。低浓度范围内，苹果表皮残留农药的浓度与拉曼峰强度均成良好的线性相关性。该方法无需复杂的样品前处理过程，检测时间只需数分钟，可以对苹果表皮的农药残留进行定量分析，结合小型化便携式拉曼光谱仪和集成化的拉曼探头，可以为苹果表皮农药残留的现场快速检测提供一种便捷方法。

2.3 苹果表皮残留农药去除方法比较结果

2.3.1 苹果表皮的农药残留量随时间的衰减 探究苹果表面农药残留随时间变化的关系，一方面可以分析喷洒农药后药效持续时间，为农药喷洒周期提供指导，另一方面，为苹果采摘前使用农药的安全间隔期提供依据。

图7 苹果表皮多菌灵SERS谱及拟合曲线

取200 μL浓度5.0 mg/L的农药滴加在不同苹果上的标记区域内，置于通风的环境中自然晾干，待表面晾干后选取一组苹果进行表面农药残留测定，之后每隔24 h选取另一组进行测定。

苹果表皮农药残留随时间衰减变化如图8所示，表3为对衰减变化的拟合曲线。分析可知，倍硫磷农药在苹果表面的残留随时间的推移大致成指数衰减，大约1～2 d后特征峰强度衰减为e-1，即衰减时间常数为1～2 d；多菌灵随时间衰减较慢，约4～5 d衰减为e-1，即衰减时间常数为4～5 d，之后趋于稳定，一周以后仍可以探测到两种农药微弱的SERS特征峰。倍硫磷衰减较快，主要原因可能是倍硫磷为乳油试剂，所配置的倍硫磷标准液由高浓度的倍硫磷乙醇溶液用纯水稀释得到，未添加其他乳化剂，随着滴加在苹果表皮溶液的蒸发倍硫磷也会有蒸发损失。印证了苹果表皮检测农药残留时与纯品检测存在差异的原因。因此，实际喷洒的倍硫磷农药会添加乳化剂，以使得倍硫磷在苹果表皮的药效时间更长。虽然农药残留会随时间衰减，但是一段时间后衰减变缓，并趋于稳定，说明农药残留可以长期存在于苹果表面，造成环境污染、食品污染等。因此，控制农药的用量以及苹果入市前的禁药期对食品安全问题尤为重要。农药使用说明书提到苹果采摘前两种农药的禁药期为10～20 d，根据实验所得农药衰减时间常数，该禁药期时间是合理的。

2.3.2 苹果表皮农药残留不同清洗方式的效果 苹果食用之前，能否清洗干净苹果表面的有害残留是最受关注的问题，生活中常用的清洗剂有清水、淡盐水、小苏打水、果蔬洗涤剂等，本文分别针对这4种清洗方式的清洗效果以及清洗效率进行研究。将滴有农药的苹果分别置于清水、1%淡盐水、1%小苏打水、0.5%果蔬洗涤剂中浸泡，每隔2～5 min选取一组苹果进行农药残留测定，最多浸泡20 min。分别作出不同清洗剂农药残留随浸泡时间的变化关系曲线，对比分析每种清洗剂的清洗效率以及最终清洗效果。为日常生活中果蔬的清洗提供指导。

图8 苹果表皮农药残留随时间衰减规律

表3 苹果表皮农药残留随时间衰减拟合曲线

不同清洗剂对苹果表皮农药残留清洗效果如图9所示。苹果经浸泡可以清洗掉大部分的农药残留，随浸泡时间的增长，大体成e指数衰减,相应的拟合曲线见表4。4种不同清洗剂对倍硫磷的清洗效果，衰减系数分别为：清水(5.3)、盐水(0.7)、小苏打水(1.3)、果蔬洗涤剂(1.9)。盐水的清洗效果较好，清水清洗效果一般，表现为清洗效率较低，时间常数更长，超过5 min。对多菌灵的清洗效果与倍硫磷类似，清水清洗效果一般，时间常数大约24 min，盐水和果蔬洗涤剂的清洗方式对多菌灵清洗效果显著，时间常数在3 min左右。清水清洗效果不佳与这两种农药在水中溶解度低有关，清水无法有效的将苹果表皮农药残留洗脱下来。综合分析4种清洗剂对两种农药的清洗效果可知，盐水和果蔬洗涤剂能更快的将农药残留洗脱下来，日常生活中购买的苹果可利用盐水或果蔬洗涤剂进行浸泡清洗，能有效去除农药残留，由于果蔬洗涤剂也可能在苹果表面残留不易冲洗干净，因此日常生活中可用淡盐水浸泡10 min左右再用清水冲洗。仅用清水清洗效果较慢，但是20 min之后测得的农药残留量与其他清洗剂最终清洗效果相当，可见只用清水浸泡清洗可以通过延长时间达到较好的清洗效果。

图9 不同清洗剂对苹果表皮农药残留清洗效果

表4 不同清洗剂对苹果表皮农药残留清洗效果拟合曲线

3 结语

本研究提出了一种苹果表皮农药残留无损、快速检测的方法，采用表面增强拉曼光谱技术结合纳米检测棒对苹果表面残留的倍硫磷和多菌灵农药进行了快速无损检测。结果显示，该方法检测灵敏度高、方便快捷，对倍硫磷和多菌灵农药的检测在低浓度范围内特征峰强度与浓度成良好的线性关系，可作为定量分析苹果表皮农药残留的参考。且苹果表皮倍硫磷和多菌灵的最低检测浓度分别为0.1和0.05 mg/L。

分析苹果表皮倍硫磷和多菌灵农药残留行为，残留随时间成e指数衰减，衰减时间常数分别为1～2 d和4～5 d。农药可长期残留在表皮，因此苹果食用前的清洗对人类健康尤为重要。使用纳米检测棒分别对4种清洗剂清洗效果进行检测、分析，农药残留随浸泡时间的增长成e指数衰减，由于农药难溶于水，清水的清洗效果一般，需要增加浸泡时间，果蔬洗涤剂、淡盐水对农药有良好的清洗效果。综合考虑可食用性、清洗效果等因素，苹果食用前可用淡盐水浸泡10 min以上，再用清水冲洗，或者只用清水浸泡20 min以上，都能有效去除大部分农药残留。