液液提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定人体血液中16种有机磷酸酯

2021-12-18侯敏敏史亚利蔡亚岐

色谱 2021年1期

侯敏敏, 史亚利*, 蔡亚岐

(1. 中国科学院生态环境研究中心, 环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京 100083; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

近几年,多溴联苯醚(PBDEs)因具有持久性、长距离迁移性、生物累积性以及毒性而在世界范围内被禁止使用并且逐渐退出市场,有机磷酸酯(OPEs)作为其优良的替代品,生产量和使用量显著增加,作为阻燃剂和增塑剂广泛应用于泡沫、塑料、纺织制品以及液压油和各种建材产品中[1-3]。2015年,OPEs的全球使用量高达68万吨,年使用增长率约为7.9%[4]。OPEs通过物理的方式添加进各种消费品中,因此很容易通过挥发,磨损或者渗滤的方式释放进入到环境中[1]。目前,已经有大量研究在大气[5,6]、水体[6-8]、土壤[9]、沉积物[7,10]、灰尘[11,12]等多种环境介质以及生物体[8,13]中检出OPEs。此外,毒理学研究已经证实部分OPEs的暴露可能会对人体及其他生物体造成不良影响,包括致癌性[14]、神经毒性[15]、生殖毒性[16]、甲状腺激素[17]和雌激素干扰效应[18]、哮喘以及过敏性鼻炎[19]等。

环境介质中的OPEs可通过呼吸、灰尘摄食、真皮吸收或者饮食进入人体,进而对人体健康造成危害。目前国内外已经有较多的研究在人体尿液[20,21]、血液[22-25]、头发[26-28]、指甲[27]以及母乳[29,30]等样品中检测到OPEs的存在,表明了普遍的人体OPEs的暴露。进入人体内的OPEs很容易代谢成其二酯类或者羟基类的化合物,进而通过尿液排出体外[31-34]。因此,目前大多数研究主要集中于尿液中OPEs代谢物的检测,将其作为人体OPEs暴露的生物标志物[35]。然而,有些OPEs,如磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP),在人体内的代谢速率较慢[31]。此外,尿液中某一种OPEs的代谢物可能是由多种不同的OPEs代谢产生,如磷酸三苯酯(TPHP)、2-乙基己基二苯磷酸酯(EHDPP)和间苯二酚双(磷酸二苯酯)(RDP)均可以代谢产生磷酸二苯酯(DPHP)[31,36-38]。并且,有些OPEs二酯代谢物,如磷酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、磷酸二丁酯(DnBP)和DPHP,有直接的生产和使用,并且已有研究在室内灰尘和食品中检测出它们的存在[39,40],表明这些物质可能会直接暴露于人体。因此,对于某些OPEs,相比尿液中的代谢物,血液中母体物质的检测可能更能准确反映人体对于OPEs的暴露。且因人体内血液与各个器官和组织直接接触,血液中化合物的浓度更能反映到达特定组织的剂量,进而更准确地评估人体健康风险。

目前,已有少量研究检测了人体血液中OPEs的存在,通过使用不同的分析检测方法,包括固相萃取(SPE)联用GC-MS[41-43]和液液提取-双SPE柱固相萃取和LC-MS/MS联用[22,25]。但是,这些研究所检测的OPEs种类相对较少。另外,随着工业和科学研究的不断推进,不断有结构性能各异的OPEs新产品被大量生产和使用,近几年已经有较多新型的OPEs在各种消费品及其相关环境中检出。因此,建立同时检测人体血液样品中多种OPEs的分析方法具有重要意义和迫切需求。本工作针对16种OPEs,通过优化SPE等前处理方法和色谱-质谱方法,建立了灵敏高效的同时检测人体血液中多种OPEs的高效液相色谱-串联质谱分析方法,为研究人体OPEs的暴露水平和积累特征提供方法基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Ultimate 4500液相色谱仪及Triple quadTM4500三重四极杆质谱仪(MS/MS,美国AB SCIEX公司),系统配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst 1.6.2工作站;氮吹浓缩仪;ENVI-18 SPE小柱(6 mL, 500 mg; Supelco)。

甲醇、乙腈(色谱纯,美国Merck公司);二氯甲烷(色谱纯,美国Fisher公司); Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司)。

16种目标分析物信息如表1所示,其中TMP、TEP、TPrP、TnBP、TiBP、TEHP、TBOEP、TCEP、TCIPP、TDCPP、TPHP、TMPP、EHDPP和CDPP购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;RDP、BABP、TCIPP-d18和TCEP-12购自加拿大Toronto Research Chemicals公司;内标TMP-d9、TEP-d15和TPrP-d21购自加拿大C/D/N Isotopes公司;TnBP-d27和TPHP-d15购自美国Cambridge Isotope Laboratories公司。

血液样本:采集对象为山东省济南市的15名健康老年人,所有参与志愿者在采样前均详细阅读并签署了知情同意书。

表 1 16种OPEs的英文全称、简称、分子式、相对分子质量及CAS号

1.2 血液样品前处理

参考文献[44]的方法进行样品前处理(略有修改),并进行验证。具体过程如下:血液解冻后取0.5 mL于15 mL玻璃离心管中,加入10 μL内标混合溶液(1 ng/μL),涡旋混匀后静置30 min,再加入10 mL乙腈,摇床萃取12 h,离心后将上清液转移至另一个干净离心管中;再向残余部分加入2 mL乙腈,按照上述步骤重复萃取两次,每次30 min,最后将3次萃取所得上清液合并,氮吹浓缩至约0.5 mL,加入30 mL超纯水稀释待净化。考虑到部分OPEs物质容易挥发,氮吹过程中氮气流速以液面轻微波动即可,氮吹温度为50 ℃。

依次用5 mL乙腈和5 mL超纯水活化ENVI-18小柱,将萃取液加载到活化好的小柱上,上样完成后先用10 mL的超纯水清洗小柱;清洗液流干后,在负压下对小柱抽干约40 min,之后用6 mL含有25%二氯甲烷的乙腈进行洗脱,洗脱液氮吹至近干,甲醇定容至1 mL,通过0.22 μm的有机滤膜后进行UPLC-MS/MS测定。

1.3 仪器检测条件

色谱色谱柱Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),连接保护柱Acquity UPLC BEH C18(5 mm×2.1 mm);流动相:A为5 mmol/L醋酸铵缓冲溶液,B为甲醇(MeOH);柱温25 ℃,流速400 μL/min;梯度洗脱程序为:0～1 min, 10%B～40%B; 1～4 min, 40%B～90%B; 4～4.1 min, 90%B～100%B,维持4.9 min; 9～9.1 min, 100%B～10%B,维持3.9 min。

质谱电喷雾离子源(ESI),正离子多重反应监测(MRM)模式;针泵进样,在确定母离子和子离子对后,对解簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞电压(CXP)等参数进行优化(见表2)。接入色谱流动相后,对其他参数进行优化,结果如下:气帘气压为0.14 MPa,碰撞气压为0.02 MPa,离子源喷雾电压为5 000 V,温度为600 ℃,雾化气为0.34 MPa,辅助雾化气为0.28 MPa。

2 结果与讨论

2.1 SPE柱的回收率

通过在ENVI-18 SPE柱上加载30 mL含100ng OPEs和10 ng内标的超纯水溶液,考察了该SPE柱对16种目标OPEs的回收率,16种OPEs的回收率为54.6%～104%(见表3), 7种内标TMP-d9、TEP-d15、TPrP-d21、TCIPP-d18、TCEP-12、TnBP-d27和TPHP-d15的回收率分别为61.3%±5.04%、70.8%±5.49%、99.1%±8.06%、113%±3.09%、98.9%±6.95%、96.6%±5.15%和95.9%±2.90%,该回收率满足物质分析的需求。

表 2 16种OPEs的质谱参数

表 3 ENVI-18 SPE柱对16种OPEs的提取回收率

2.2 色谱柱和流动相的选择

本研究考察了Acclaim Mixed-Mode HILIC-1(150 mm×2.1 mm, 5 μm; Thermo Fisher)和Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm; Waters)2种类型的色谱柱对16种OPEs的分离和保留能力。Mixed-Mode HILIC-1色谱柱的固定相由疏水性烷基链组成,末端是二醇基团,这使其既具有疏水保留,又具有亲水相互作用。BEH C18柱作为一种通用的C18色谱柱,适用于各种分析物的分离。比较结果表明,2种色谱柱均能对目标化合物实现较好的分离,但个别疏水性的OPEs如TEHP等的分离,相比C18柱,它们在Acclaim Mixed-Mode HILIC-1柱上的保留时间较长,考虑到分析效率,本研究最终采用UPLC BEH C18色谱柱进行16种OPEs的UPLC-MS/MS分析。

比较UPLC BEH C18色谱柱在甲醇-2 mmol/L、5 mmol/L、50 mmol/L乙酸铵水溶液3种流动相组成条件下对16种OPEs分离的峰形和灵敏度,结果表明,当采用5 mmol/L的乙酸铵水溶液时,大多数OPEs的响应略高且获得良好分离。因此,本研究最终采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。16种OPEs标准溶液的总离子流色谱图见图1。

图 1 16种OPEs标准品的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion chromatograms of the 16 OPE standards

2.3 方法学表现

按照优化后的检测条件测定0.1、0.5、2、5、10、20、50 ng/mL的混合标准溶液,以目标物质与内标的浓度比为横坐标,峰面积比为纵坐标进行线性回归,结果表明,16种OPEs在0.1～50 ng/mL范围内有良好的线性关系,线性相关系数均在0.995以上。检出限(LOD)以3倍信噪比计算,结果见表4, 16种OPEs的LODs为0.003 8～0.882 ng/mL。

表 4 16种OPEs在人体血液中3个水平下的加标回收率(n=3)

为了考察方法的有效性和精密度,进行了基质加标回收试验。将之前采集的几个志愿者的血液样品混合,作为基质。分别取0.5 mL的血液基质,加入2、20、40 ng/mL的混合标准溶液,每个浓度水平进行3次重复试验,按照优化的样品前处理和检测条件进行实验。结果见表4,除TMP外,其余15种OPEs的基质加标回收率为53.1%～126%,相对标准偏差为0.15%～12.6%。对于TMP,采用其氘代同位素TMP-d9作为内标物对TMP在样品处理过程中的损失进行校正,TMP-d9的加标回收率为39.1%±3.97%。其余6种内标的加标回收率为66.8%±6.85%～91.6%±3.52%。

2.4 样品基质效应评估

本研究采用提取后添加法评估人体血液样本的基质效应(ME),具体过程如下:分别取6个血液样本,不添加任何目标物质以及内标,根据样品前处理过程进行萃取净化,将最终获得的萃取液进行混合(6 mL)作为基质空白。取1 mL空白基质加入10 ng的标准物质和内标,按照样品检测方法测定,获得加标基质响应(A)。另取1 mL空白基质,不加任何标准上机去检测,获得空白基质响应(B),C为纯溶剂中相同浓度待测物质的响应。进行3个平行,目标化合物的基质效应通过如下公式计算:

结果表明,人体血液样本中待测的16种OPEs的基质效应为56.4%±12.4%～103.0%±1.1%。其中,TCEP(88.6%±1.3%)和TCIPP(77.5%±4.3%)存在较弱的基质抑制,可以通过其相应的同位素内标(TCEP-d12(75.3%±8.9%)和TCIPP-d18(77.4%±7.5%))进行消除。此外,RDP、TMPP、EHDPP和BABP存在明显的基质抑制,分别为75.8%±1.4%、68.4%±1.0%、56.4%±12.4%和58.5%±0.4%,这4种待测物质没有相应的同位素内标。本研究采用内标法定量,使用TPHP-d15(77.4%±7.5%)作为它们的内标进行定量,可以部分消除基质效应的影响,满足分析要求。

2.5 实际样品测定

使用本研究建立的分析检测方法,对采集的15个人体血液样本中的OPEs进行分析测定,结果见表5。16种OPEs的总浓度为1.50～7.99 ng/mL,除TMP、TEP、TPrP、CDPP、TMPP、BABP、RDP和TDCPP外,其余8种OPEs检出率均高于50%。其中TiBP、TCEP和TCIPP的中位浓度最高,分别为0.813 ng/mL、0.764 ng/mL和0.690 ng/mL。