郭园园，张浩然,2，卓士铉，杨万斌，傅鹤群，李雅静，张正光

（1.南京中医药大学医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023；2.南京医科大学基础医学院，江苏 南京 211166）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种常见消化道恶性肿瘤，死亡率很高。据报道[1]，全球每年因罹患肝癌而死亡的人数超过50 万，其中我国作为肝癌大国，约占总数的50%。目前临床上常使用放化疗和手术切除法治疗肝癌。由于肝癌发病具有一定隐匿性，一旦确诊即为晚期，仅有20%的患者能够接受手术治疗[2]。此外，肝癌具有很强的转移侵袭性，手术愈后不佳，而化学药物治疗往往存在疗效不显著以及毒副作用强等弊端[3]。因此，寻求一种天然、高效、安全的抗肝癌药物，尤其是寻找能够抑制肿瘤细胞转移的药物迫在眉睫。桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）作为临床传统中药桔梗的药效物质基础之一，具有抗炎、抗氧化、抗衰老及抗肿瘤等多种药理学功效[4-7]。已有研究表明[8-11]，PD 能够有效抑制如胆囊癌细胞、口腔鳞状细胞癌细胞、子宫内膜癌细胞、多发性骨髓瘤细胞等多种肿瘤细胞的迁移侵袭，而关于PD 抑制肝癌细胞迁移侵袭的相关机制尚未完全阐明。人肝母细胞瘤细胞系（human hepatocellular liver carcinoma，HepG2）是目前应用最广泛的人源肝癌细胞系之一，常作为药物研究的肝癌体外细胞模型。本研究通过网络药理学及体外实验方法，初步探究了PD 抑制肝癌HepG2 细胞迁移及侵袭的潜在分子机制，以期为临床应用PD 治疗肝癌提供相关研究基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、实验试剂与器材 人肝母细胞瘤（人肝癌）HepG2 细胞株（中国科学院上海生科院细胞资源中心）；DMEM、新生胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素链霉素双抗（Penicillin-Streptomycin）、胰酶（含0.25%EDTA，酚红）（美国Gibco 公司）；桔梗皂苷D 药物粉末（上海源叶生物科技有限公司）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS，江苏凯基生物技术股份有限公司）；细胞增殖-毒性检测（CCK-8）试剂盒（biosharp 公司）；Transwell 小室、Matrigel 基质胶（美国Corning-Costar 公司）。

1.1.2 实验仪器 酶标仪（Bio Tek Instruments Inc.）；电泳仪（上海天能科技有限公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories 公司）；超净台（苏州苏洁净化设备有限公司）；高速冷冻离心机、低温冰箱、电子分析天平、PCR 仪（美国Thermo Fisher 公司）；显微镜（Olympus Corporation）；细胞培养箱（上海宝赛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物及疾病潜在靶标的预测 通过HERB 数据库（http://herb.ac.cn/）和PharmMapper 数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）查询PD 可能的匹配靶标，下载并整合相关靶标信息。通过GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），以“liver cancer metastasis”（LCM）为关键词，检索肝癌转移相关靶标信息。通过TBtools 软件绘制韦恩图，筛选出PD 与肝癌转移的共同作用靶标。

1.2.2 构建疾病-药物-靶标相关网络及蛋白互作网络 利用Cytoscape3.7.1 软件建立疾病-药物-靶标相关网络，STRING 数据库（https://string-db.org/）构建并分析蛋白质-蛋白质相互作用网络。

1.2.3 GO 富集分析与KEGG 富集分析 将筛选出的共同作用靶标导入到Rstuio 软件中，利用“cluster－Profiler”包进行GO 富集分析与KEGG 富集分析。其中GO 富集分析包括3 个部分，分别为生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）。以P＜0.05 对富集得到的主要BP、CC、MF 及KEGG 信号通路进行筛选并进行可视化分析。

1.2.4 PD 药液配置 配置浓度为10 μmol/L 的PD母液。使用时，用含10%胎牛血清的完全培养基和PD 母液配置浓度梯度的溶液[0 μmol/L（对照组）、4、8 μmol/L（PD 给药组）]，随后进行相关实验。

1.2.5 细胞培养与传代 使用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM 完全培养基复苏HepG2 细胞，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。待细胞生长至密度为85%左右进行传代。进行生物学实验的HepG2 细胞应均处于对数生长期。

1.2.6 细胞形态学观察 待细胞贴壁生长至65%左右，弃去培养基，用1×PBS 清洗后加入含有不同浓度PD 的DMEM 完全培养基（0、1、2、4、8、16 μmol/L），待培养至24、48 h 时置于显微镜下观察HepG2 细胞生长状况与细胞形态。

1.2.7 CCK-8 法筛选合适的PD 给药浓度 向96 孔板中加入100 μl 的细胞悬液，24 h 后细胞贴壁弃去原培养液，向每孔中加入含不同浓度PD 的完全培养基培养48 h，随后加入CCK-8 液，于37 ℃孵育1 h，使用酶标仪检测其在450 nm 处的OD 值，实验至少重复3 次。

1.2.8 CCK-8 法检测细胞增殖能力 将细胞接种于96 孔的细胞培养板中，每孔加入100 μl 的细胞悬液，待培养至48 h 时弃去原培养液，加入含有CCK8液孵育1 h，使用酶标仪检测其在450 nm 处的OD值，实验至少重复3 次。

1.2.9 伤口愈合实验 预处理细胞48 h 后，使用200 μl无菌枪头在6 孔板中划出直线，PBS 洗去多余的细胞碎片后，加入培养基继续培养，分别于0、36 h 时拍照观察，实验至少重复3 次。

1.2.10 Transwell 迁移和侵袭实验 在迁移实验中，向Transwell 上室中加入100 μl 不含有血清的DMEM 培养基重悬细胞，下室加入含20%胎牛血清的DMEM 培养基500 μl，分别于6、12、24 h 取出小室，PBS 洗涤3 次，用棉签擦去微孔滤膜上室残留细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色20 min，PBS 洗涤后风干。将小室置于载玻片上用显微镜观察穿过滤膜的细胞并计数。每组以5 个视野的细胞进行计数，实验至少重复3 次。侵袭实验与迁移实验操作步骤基本相同，区别在于在小室上室中铺上了稀释后的基质胶（以无血清DMEM 培养液稀释8 倍）。

1.2.11 Western Blot（WB）实验 将细胞接种至6 孔板中，将细胞预处理48 h 后，弃去培养液。用PBS 清洗后，于每孔中加入的适量RIPA 裂解液（强），用细胞刮收集细胞裂解液，置于1.5 ml 离心管中，反复吹打。使用4 ℃高速冷冻离心机，以12 000 g 离心15 min。使用BCA 法测定并统一蛋白浓度。上样后，通过SDS-PAGE 电泳、转膜、脱脂奶粉封闭、孵育一抗、孵育二抗、曝光等步骤检测相关蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 使用Image J 对图像数据进行比对分析，使用GraphPad Prism9 进行实验数据的统计分析，计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学预测PD 及肝癌转移的共同作用靶标 通过HERB 数据库及PharmMapper 数据库查询PD 可能的匹配靶标（Norm Fit＞0.7），下载并整合相关靶标信息，共得到PD 可能的靶标共47 个。通过GeneCards 数据库收集肝癌转移相关靶标8973 个，见图1。通过TBtools 软件绘制韦恩图，筛选出PD与肝癌转移的共同作用靶标有43 个，分别为CASP3、CASP8、EGFR、ESR1、GATA3、IFNG、IL2、IL4、IL10、MMP9、NOS2、RELA、TNF、IKBKG、CA2、HCK、F2、BCHE、PIM1、CDK2、TTR、CFB、MAPK10、CA1、TREM1、CDK5R1、MAPK8、NR1H2、GSR、AURKA、AR、HSPA8、ANG、ESR2、CDK6、PDPK1、PGR、SRC、NQO1、HSD17B1、AKR1B1、MTAP、SHBG。使用Cytoscape 软件建立疾病-药物-靶标相关网络，见图2。

图1 PD 与肝癌转移共同作用靶标的韦恩图

图2 Cytoscape 软件建立疾病-药物-靶标相关网络

2.2 蛋白互作网络分析 将43 个共同作用靶标输入到STRING 网站，构建PD 抗肝癌转移的蛋白互作网络图，通过Cytoscape 软件中CytoHubba 插件的MCC 算法筛选出排名前10 的核心靶标，分别为CASP3、SRC、RELA、TNF、MMP9、EGFR、IL10、IL4、CASP8、MAPK8,见图3。

图3 PD 抗肝癌转移蛋白互作网络及核心靶标筛选

2.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析显示，PD抗肝癌转移涉及到1476 个相关生物学过程，包括调节炎症反应（regulation of inflammatory response，GO:0050727）、细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress，GO:0062197）、外部凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway，GO:0097191）、细胞内受体信号通路（intracellular receptor signaling pathway，GO:0030522）等；涉及到9 个细胞组分，包括焦点粘附（focal adhesion，GO:0005925）、细胞-底物连接（cell-substrate junction，GO:0030055）、膜筏（membrane raft，GO:0045121）、膜微结构域（membrane microdomain，GO:0098857）、膜区域（membrane region，GO:0098589）等；涉及到76 个分子功能，包括细胞因子受体结合（cytokine receptor binding，GO:0005126）、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity，GO:0004674）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding，GO:0031625）等，见图4。KEGG 富集分析显示，PD 抗肝癌转移涉及到的相关信号通路包括白介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway，hsa04657）、T 细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway，hsa04660）、C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway，hsa04625）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway，hsa04668）等，见图5。

图4 PD 抗肝癌转移的GO 富集分析

图5 PD 抗肝癌转移的KEGG 富集分析

2.4 PD 对HepG2 细胞形态的影响 对照组（0 μmol/L）的HepG2 细胞生长状况良好，而给药组HepG2 细胞形态均发生了不同程度的改变，包括皱缩、细胞内出现空泡、凋亡等现象。随着PD 浓度的升高，HepG2 细胞形态变化愈发显著，见图6。

图6 显微镜下不同PD 浓度预处理24 h 的HepG2 细胞形态图

2.5 PD 最适给药浓度分析 CCK-8 实验显示，当药物浓度为0.5～4 μmol/L 时，其在450 nm 处吸光度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而当药物浓度为≥8 μmol/L 时，其在450 nm 处吸光度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即PD 的最适给药浓度为8 μmol/L，见图7。

图7 PD 最适给药浓度分析

2.6 PD 对HepG2 细胞增殖能力的影响 与对照组相比，当PD 的浓度达到4 μmol/L 与8 μmol/L 时，细胞的增殖能力均受到抑制，并呈剂量依赖性降低，见图8。

图8 不同PD 给药浓度处理的HepG2 细胞活性变化图

2.7 PD 对HepG2 细胞迁移侵袭能力的影响 对照组HepG2 细胞的划痕愈合率为（70.32±0.49）%；PD给药组4 μmol/L 的划痕愈合率为（33.764±2.54）%；8 μmol/L 的划痕愈合率为（20.25±2.01）%，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图9。为了进一步证实PD 对于HepG2 细胞迁移侵袭能力的抑制作用，Transwell 迁移实验结果显示，PD 给药后HepG2 细胞迁移能力受到明显的抑制，结果与伤口愈合实验吻合，见图10；侵袭实验结果显示，PD 给药后HepG2 细胞的侵袭能力亦受到明显抑制，结果与迁移实验相同，见图11。

图9 不同浓度PD 预处理的HepG2 细胞0、36 h 的划痕图（200×）及愈合率定量图

图10 Transwell 迁移实验结果

图11 Transwell 侵袭实验结果

2.8 E-cadherin 蛋白表达水平分析 WB 实验显示，与对照组相比，PD 给药组E-cadherin 表达量升高，见图12。

图12 PD 抑制转移与粘附标志物蛋白E-cadherin 的表达水平

3 讨论

肝癌作为一种极常见的消化道恶性肿瘤，具有临床治愈率低、易复发转移、预后不良等特点，已成为致死率极高的癌症之一，对人类生命健康造成了极大威胁[12-14]。现今多项研究证实[15-18]，中医药在包括肝癌在内的多种癌症的治疗中疗效确切，具有广阔的发展前景。相比西医的手术、放化疗等常规治疗方法，中医药疗法已有效应用于肿瘤治疗的各个领域，其中中药复方及其单体具有低毒、高效、安全等特点，已在癌症临床治疗中被广泛使用，如参芪扶正注射液、消癌平注射液、榄香烯注射液等，在临床恶性肿瘤的治疗中扮演着重要角色，亦可与西医常规抗癌手段相结合，体现中西医结合治疗肿瘤的特色。

传统中草药桔梗作为中医临床传统用药，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓等功效，常被用于肺部相关疾病的治疗，而桔梗的主要药效成分之一——PD，其近年来已成为研究热点。目前，PD 的抗癌作用已在多项研究中得到确证，其生物学过程涉及抑制肿瘤细胞增殖、抗血管生成、诱导自噬性死亡、促进细胞凋亡等多个方面[19-22]。同时，PD 已经被证实能够有效抑制多种肿瘤细胞的迁移与侵袭行为，但PD 抑制肝癌细胞的迁移侵袭的机制尚未完全阐明。本研究以此为切入点，从网络药理学及体外实验出发，探究了PD 抑制肝癌细胞迁移侵袭的潜在分子机制，以期为临床利用PD 治疗肝癌提供相关理论与实验支撑。本实验先从网络药理学出发，初步探讨了PD抗肝癌转移可能的分子机制，其中韦恩图显示PD与肝癌转移共有14 个共同靶标；GO 富集分析表明，相关靶标的生物学过程涉及到调节炎症反应及正性调控细胞间粘附等关键途径；KEGG 通路分析显示，PD 抗肝癌转移可能与包括白介素-17 信号通路、T 细胞受体信号通路等密切相关。体外实验则以人肝母细胞瘤HepG2 细胞株作为研究对象，首先通过对细胞进行形态学观察，发现与对照组相比，PD给药组中细胞皱缩变圆、出现空泡，死亡细胞明显增多；随后通过CCK-8 实验、伤口愈合实验、Transwell实验进一步确证PD 能够抑制肝癌HepG2 细胞增殖、迁移及侵袭行为；且WB 实验结果显示，PD 可能是通过上调细胞粘附的关键标志物E-cadherin 蛋白的表达，正性调控细胞粘附的生物学过程，从而抑制肝癌细胞的迁移侵袭能力。

本研究尚存在一定不足，今后将对相关靶标及信号通路进行进一步验证，以深入探索PD 抗肝癌转移的分子机制，同时亦会开展体内相关研究，为将来临床有效利用PD 治疗肝癌转移提供参考。