刘文华 于小雲 魏敏 段世航 张长朝 郭东会＊

（山东第一医科大学生命科学学院，山东泰安 271016）

黄连别名味连、鸡爪连，属毛莨科、黄连属草本植物，有清热解毒的功效，可以降血糖、治疗痢疾等。连翘属木樨科、连翘属落叶灌木，有清热、解毒、消肿等功效，可治温热、丹毒、斑疹、小便淋闭。

提取总黄酮的方法包括浸提法[1]、超声法[2]、超临界流体萃取法[3]、酶提取法等[4]，通过不同的微生物发酵方法从黄连和连翘中提取黄酮类化合物的文献较少。此方法通过微生物发酵方法生产复合酶制剂，并利用它们分解植物细胞壁中的木质素和纤维素等大分子物质，从而促进析出有效成分。此方法，操作更简便，花费更少。本实验采用两种固体发酵法方法提取黄酮过程:一为使用黑曲霉或枯草芽孢杆菌单一菌种；二为使用两种菌混合来。并分析其黄酮的抗氧化活性为黄连和连翘的开发与使用提供丰富的理论基础[5]。

1 材料与方法

1.1 试材

黄连、连翘（安国市旭芳中药材经营有限公司），粉碎。黑曲霉、枯草芽孢杆菌由山东第一医科大学生命科学学院微生物实验室提供。芦丁（中国药品生物制品检定所）、DPPH（上海源叶生物科技有限公司）、啡啰嗪（阿拉丁试剂）；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 黄酮提取方法的优化

1.2.1.1 超声提取中草药黄酮。中草药（黄连或连翘）10g，加乙醇（65mL，60%），30℃、45Hz、功率为50%，超声（50min），纱布（4 层）过滤。取滤液20mL,用乙醇（60%）将液体定容至100mL，即为中草药黄酮的提取液，将提取液放入冰箱备用[5]。

1.2.1.2 黑曲霉固体发酵法辅助提取中草药黄酮。固体发酵培养基[6]：黄连（连翘）10g、麸皮10g、蒸馏水35mL, 灭菌（121℃，20min）。接入黑曲霉，摇床（28℃、150r/min 恒温振荡）培养7d。后按照超声提取中草药黄酮进行实施。

1.2.1.3 枯草芽孢杆菌固体发酵法辅助提取中草药黄酮。固体发酵培养基[7]：黄连（连翘）10g、玉米面3g、豆粕9g、麸皮18g、蒸馏水44mL，灭菌（121℃，20min）。将枯草芽孢杆菌接入培养基，摇床（37℃、150r/min 恒温振荡）培养7d。后按照超声提取中草药黄酮进行操作。

1.2.2 黄酮浓度的测定。

1.2.2.1 不同浓度芦丁溶液的测定[8]。芦丁10mg，用60%乙醇溶解后，转移至50mL 容量瓶，加入60%乙醇稀释至刻度,0.2g/L 的芦丁标准溶液。在1-6 号容量瓶（10mL）中加入量取好的芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别加入0.3mL 亚硝酸钠（5%），混匀静放10min，加入0.3mL 硝酸铝（10%），混匀静放10min，加入2mL 氢氧化钠（1mol/L），用60%乙醇稀释至刻度测吸光度（510nm）。

1.2.2.2 黄酮浓度的测定[9]。将不同黄酮提取液1mL 加入容量瓶（10mL）中，其他步骤与“1.2.2.1”方法相同。计算黄酮提取液黄酮含量E（mg/g）。E=A×C×V×10-3/W 式中，A 为样品液测黄酮稀释的倍数，C 为经芦丁回归方程中求得的黄酮量（mg/L），W为重量（g），V 为定容体积（mL）。

1.2.3 黄酮的抗氧化活性研究。

1.2.3.1 黄酮对羟基自由基的清除作用[10]。在试管中按序加入1mL Fe2+（9mmol/L），1mLH2O2（8.8 mmol/L），混匀静放10min；取不同浓度的样品溶液2mL，混匀静放10min，加入1mL 水杨酸-乙醇溶液（9mmol/L），混匀静放30min，测其吸光值（510nm），其清除率计算公式：

式中：E 为羟基自由基清除率（%）；A0为空白对照液的吸光值；Ax为加入不同黄酮浓度的样品溶液的吸光值；Aj为不加水杨酸-乙醇的吸光值。

1.2.3.2 黄酮对DPPH 自由基清除作用[11]。在10mL 试管中按序加入不同浓度的黄酮样品 1mL，0.25mLDPPH 溶液（0.5moL/L），加入乙醇至10mL，避光、37 度静放20min，测其吸光值（517nm），以乙醇作空白调零。黄酮对DPPH 的清除率的计算公式：

式中：I 为DPPH 的清除率（%）；A0为空白对照的吸光值；Ax为加入不同黄酮浓度的样品溶液的吸光值；Aj为不加DPPH的吸光值

1.2.3.3 对Fe2+的抗氧化能力[12]。分别称取不同质量的菌体（10、30、50、70、90、110mg） 加入 3mL 无水乙醇， 添加2mmol/L0.05mL 的硫酸亚铁溶液混匀，添加5mmol/L 0.2mL 的菲啰嗪，静放10 分钟，分光光度计检测562nm 下测吸光度记作A 样品，蒸馏水代替样品作空白对记作A 空白。EDTA 作为阳性对照，实验方法同上，实验重复3 次。

Fe2+的螯合能力=[（A 加样-A 空白）/A 空白]×100%

1.2.3.4 铁氰化钾法进行还原能力的测定[13]。取不同浓度的黄酮样品溶液1mL 按序加入2.5mL 的磷酸钠溶液（0.2mol/L）、2.5mL 铁氰化钾（1%）,50℃恒温水浴、暗处反应20min,2.5mL 三氯乙酸（10%）。离心（3000r/min，10min），将三氯化铁（0.1%）0.5mL、双蒸水2.5mL 及上清液2.5mL 静放10 分钟,测定吸光值（700nm）。以蒸馏水代替样品作空白对照，抗坏血酸作阳性对照,每个样品需3 组平行。

2 结果与分析

2.1 固体发酵法辅助提取黄酮与“1.3.2.1”的方法相同，由分光光度法得标准曲线回归方程（横坐标芦丁浓度，纵坐标吸光度）为：Y=0.1619x+0.1035（R2=0.982）。根据回归方程计算不同方法提取黄酮的含量如图1 所示。

从图1 知，黑曲霉固体发酵法辅助提取连翘黄酮得到的黄酮含量高于同种条件下辅助提取黄连黄酮得到的黄酮含量；枯草芽孢杆菌固体发酵法辅助提取连翘黄酮得到的黄酮含量高于同种条件下辅助提取黄连黄酮得到的黄酮含量；黑曲霉固体发酵法辅助提取黄连连翘混合草药黄酮得到的黄酮含量高于枯草芽孢杆菌固体发酵法辅助提取黄连连翘混合草药黄酮得到的黄酮含量；黑曲霉枯草芽孢杆菌混合菌固体发酵法辅助提取连翘黄酮得到的黄酮含量高于同种条件下辅助提取黄连黄酮得到的黄酮含量；黑曲霉枯草芽孢杆菌混合菌固体发酵法辅助提取连翘黄酮得到的黄酮含量低于同种条件下辅助提取黄连黄酮得到的黄酮含量；黑曲霉培养基不加菌条件下得到的黄连黄酮含量、枯草芽孢杆菌培养基不加菌条件下得到的连翘黄酮含量均比加菌情况下得到的黄酮含量高，而剩余不加菌的培养方法得到的中草药黄酮含量均低于其他条件相同但加菌条件下得到的中草药黄酮含量。此方法也为其他中草药中黄酮的提取提供了理论依据。

图1 不同培养条件下黄酮含量的比较

2.2 不同菌种培养基下中草药黄酮抗氧化活性的研究

2.2.1 黄酮对羟基自由基的清除作用。由图2 可知，黄连、连翘在黑曲霉或枯草芽孢杆菌单一菌种固体培养基中得到的黄酮提取液对Fenton 体系产生的羟基自由基清除作用较强。对羟基自由基的清除能力∝黄酮提取液的浓度。所以黄连、连翘黄酮都对清除羟基自由基具有较好的效果，同时具有良好的抗氧化作用。

图2 黄连、连翘黄酮对羟基自由基的清除作用

2.2.2 黄酮对DPPH 自由基的清除作用。由图3 知，黄酮浓度在0.2-0.6g/L 时，在黑曲霉或枯草芽孢杆菌单一菌种的固体发酵培养环境中得到的黄酮提取液，DPPH 自由基的清除能力∝黄连、连翘黄酮提取液浓度，但黄酮浓度达到0.6g/L 之后，黄酮提取液对DPPH 自由基的清除能力趋于平缓。所以不同菌种发酵辅助提取的黄连、连翘黄酮都对DPPH 自由基有较强的清除作用。

图3 黄连、连翘黄酮对DPPH 自由基的清除作用

2.2.3 铁氰化钾法进行黄酮还原能力的测定。由图4 可知，在黑曲霉或枯草芽孢杆菌培养基的培养环境下的得到的黄酮提取液，黄连黄酮提取液在低黄酮浓度（0.15-0.25g/L）时，具有较高的还原能力，但随着黄连黄酮浓度的增加，还原能力却随之减弱；连翘黄酮提取液在低黄酮浓度（0.15-0.25g/L）时，具有较低的还原能力，随着连翘黄酮浓度的增加，还原能力也随之增强。此实验数据表明，黄连黄酮在低浓度下，还原能力较强；连翘黄酮浓度越高，还原能力越强。

图4 黄连、连翘黄酮还原力的测定

2.2.4 黄酮亚铁离子的螯合能力。由图5 可知，亚铁离子与啡啰嗪形成紫色络合物，在波长562nm 下有最大吸光值，随着黄连、连翘黄酮浓度的增加，亚铁离子的螯合能力随之提高。

图5 黄连、连翘黄酮亚铁离子氧化能力的测定

3 结论

该研究采用不同菌种的固体发酵法辅助提取黄连、连翘黄酮，黄酮的得率相比直接超声提取黄铜的得率降低。通过对比发现，黑曲霉、枯草芽孢杆菌单一或混合固体发酵都导致黄连、连翘黄酮含量低于不发酵直接超声提取的总黄酮含量。黑曲霉固体发酵法得黄连总黄酮含量达1.741mg/g、连翘总黄酮含量达4.836mg/g；枯草芽孢杆菌固体发酵法得到的黄连总黄酮含量达1.873mg/g、连翘总黄酮含量达2.031mg/g；黑曲霉的固体发酵法得到的黄连连翘混合草药中总黄酮含量达6.578mg/g、枯草芽孢杆菌的固体发酵法得到的黄连连翘混合草药中总黄酮含量达1.611mg/g；黑曲霉培养基中黑曲霉和枯草芽孢杆菌固体发酵法得黄连总黄酮含量达1.749mg/g、连翘总黄酮含量达2.928mg/g；枯草芽孢杆菌培养基中黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合菌固体发酵法得到的黄连总黄酮含量达4.196mg/g、连翘总黄酮含量达2.969mg/g。本实验结果显示，传统方法超声提取比微生物发酵方法提取黄酮更有优势，可能是因为黑曲霉、枯草芽孢杆菌代谢的丰富酶系对黄酮类物质发生了转变致使黄酮含量降低，具体生成何种物质尚不明确[14]。黄连、连翘黄酮对清除羟基自由基具有较好的效果，对DPPH 自由基有一定的清除能力，对Fe2+的抗氧化能力良好，还原能力相对较差，表明黄连、连翘黄酮具有很好的抗氧化作用，这为黄连、连翘的开发提供了依据。关于黄连、连翘黄酮的结构和微生物辅助提取还待深度研究。