董建国 ， 饶 丹 ， 刘 涛 ， 胡 静 ， 何书海 ， 焦凤超 ， 陈 斌 ， 黄 立 ， 赵攀登

(1. 信阳农林学院牧医工程学院 ， 河南 信阳 464000 ； 2. 河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种对养猪业危害严重的传染病，该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV的基因型分为两类(I型、II型),在欧洲流行的以Lelystad virus (LV)为代表的毒株归为I型 ； 在北美流行的以VR-2332为代表的毒株归为II型，这2种毒株之间全基因组同源性仅为60%，抗原性也有很大差异[1-2]。我国首先分离到的PRRSV毒株为CH-1a[3]，2006年高致病性毒株在我国暴发，造成了严重的经济损失[4]。近年来又流行了NADC30-like毒株。由于PRRSV的毒株较多、变异性强等特性，给该病的防控带来严峻的挑战，因此掌握PRRSV的遗传演化规律对防控PRRS十分关键。为了进一步了解广东地区PRRSV流行毒株的遗传特性，本试验在该地区分离到了PRRSV毒株，并对其全基因组进行了测序分析，掌握了该毒株的遗传演化特性，为广东地区PRRSV的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料与主要试剂 样品采自广东省某疑似暴发PRRS的猪场，采集发病猪的肺部病变组织，置于-80 ℃ 备用。Marc-145 细胞为本试验室保存；病毒DNA/RNA 提取试剂盒、Trans-5α感受态细胞、RT-PCR 相关试剂盒、胶回收试剂盒和DL2 000 DNA marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank中收录的PRRSV代表毒株全基因组序列，设计出1对扩增GP5基因的鉴定引物(GP5F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′;GP5R:5′-CATTATTGGCATGTAGGTGATAGAAAA-3′)和13对特异性引物用于扩增全基因组序列，引物由金维智有限公司合成。引物信息见表1。

表1 PRRSV全基因组扩增引物Table 1 Amplification primers of PRRSV whole genome

1.3 病料处理 将采集的病变组织剪碎，混合1 mL 的PBS在4 ℃环境下充分研磨，组织研磨液，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，得到的滤液置于-20 ℃保存。……