马虹，王学东,*，李金瓶，马义兵

1. 首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 100048 2. 澳门科技大学澳门环境研究院，澳门 999078

铬(Cr)是人体必需的微量元素之一，正常人体内只含6～7 mg，微量的Cr在促进人体胰岛素、脂肪和蛋白质合成方面均起着重要作用，但一旦摄入过量，Cr会对人体产生巨大的危害[1]。根据国际癌症研究机构(IARC)发布的清单，Cr已经被列为第一致癌物。目前，随着工业活动的增加，土壤Cr污染日益严重，Cr在土壤中主要以三价(Cr(Ⅲ))和六价(Cr(Ⅵ))2种价态存在，而二者的毒性却有着显著差别，Cr(Ⅲ)易于被土壤颗粒吸附，容易被土壤所固定，移动性和毒性都较小[2]，而Cr(Ⅵ)在土壤中能够以离子态存在，具有移动性大、毒性强和有效态含量高的特点，通常认为Cr(Ⅵ)毒性是Cr(Ⅲ)的百倍。研究发现，Cr(Ⅵ)具有强致癌变、致畸变和致突变的作用，强烈地影响植物的生长发育，并且可能会通过食物链危害人体健康[3-5]。因此，当前土壤中Cr(Ⅵ)毒性及其相关的控制标准研究备受关注。

近些年，关于土壤中金属形态、毒性及其影响因素和评价模型已有较多报道[6-10]，马义兵课题组以我国17种土壤为研究对象，系统研究了Cu、Zn和Ni对大麦、小白菜和西红柿的毒害并建立了阈值[9-11]，欧盟针对Cu、Zn、Co、Ni、Mo和Pb分别开展了其对植物、微生物和无脊椎动物的毒性和评价模型研究，这些研究对制定准确、全面的土壤环境质量标准提供了很好的数据支撑。由于金属元素自身理化性质差异等因素，很难用同样的土壤理化性质指标去描述不同元素的阈值。例如，我国目前正在实施的《土壤环境质量标准》(GB15618—2018)[12]中，针对不同的元素标准值主要考虑了土壤pH值的影响，但一些元素如Cr、As与Cu、Zn、Ni等在土壤中的形态及价态变化方面差异较大，是否可以用土壤pH值这一单一指标来描述土壤理化性质对其阈值的影响还需大量的数据去验证。

目前，Cr(Ⅵ)的生物毒性数据积累得还很少，尽管Cr(Ⅵ)对小麦[13]、蚯蚓[14]和微生物念珠菌[15]等的毒性研究已有一些报道，但关于我国大范围内不同土壤性质条件下Cr(Ⅵ)毒性阈值及相关预测模型的研究还很缺乏。基于此，本研究拟对我国土壤进行大范围取样并开展植物毒性测试，以期为土壤Cr污染的生态风险评估和修复提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂和仪器

重铬酸钾(K2Cr2O7)为优级纯，双氧水(H2O2)、尿素(CO(NH2)2)、磷酸二氢钾(KH2PO4)和氯化钾(KCl)均为分析纯，均购自北京化玻站生物分析技术有限公司。

Spectro Flame Modula电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(德国斯派克分析仪器公司)，RTOP-800Y智能人工气候箱(浙江托普云农科技股份有限公司)，Thermo Scientific Orion 9863BN pH微电极(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.1.2 供试土壤和植物

根据土壤pH值和有机质含量分布的规律，选取了我国11个不同地区理化性质差异较大的0～20 cm耕作土层的土壤样品，采集地点包括海南海口、湖南祁阳、重庆、广东广州、北京灵山、吉林公主岭、河北石家庄、陕西杨凌、河北廊坊、甘肃张掖和河南郑州11个地区，具有广泛的代表性。土壤pH值变化范围在4.93～8.86，有机碳含量为0.6%～4.3%，阳离子交换量为6.36～28.7 mol·kg-1，土壤样品的基本理化性质如表1所示。所有土样风干后均过2 mm的尼龙筛，备用。供试植物种子为河南省农业科学院培育的驻大麦6号。

1.2 实验方法

1.2.1 土壤样品的制备

根据土壤pH值和有机碳含量，选择了海南海口、河南郑州和北京灵山3种理化性质差异较大的土壤进行大麦根伸长预实验，最终确定2组外源Cr(Ⅵ)添加浓度，分别为高添加组(包括海南海口和北京灵山2个土壤类型)和低添加组(其他剩余9种土壤)，高添加组外源添加Cr(Ⅵ)浓度为0、8、16、32、64、128、256和512 mg·kg-1；低添加组外源添加Cr(Ⅵ)浓度为0、1、2、4、8、16、32和64 mg·kg-1，每组实验设3个重复。外源Cr(Ⅵ)以重铬酸钾(K2Cr2O7)的水溶液形式添加到土壤，添加量以纯Cr含量计算。具体添加方法为称取400 g土壤，按溶液/土壤质量比为1∶20的比例向土壤中喷洒已配好的不同浓度Cr(Ⅵ)溶液，充分拌匀直到没有结块为止，静置一夜后加入去离子水至最大田间持水量，土壤培养2 d后风干、粉碎，然后过2 mm尼龙筛备用。

1.2.2 土壤理化性质的测定

测定的主要土壤理化性质包括pH值、电导率、有机碳含量、粘粒含量、阳离子交换量以及铁、铝和锰氧化物含量。其测定方法如下[10]：使用pH计和微电极仪测量土壤pH值和电导率。总碳的测量为高温燃烧法，无机碳的含量采用Pressure-Calcimeter法测定，有机碳含量通过总碳减无机碳获得。土壤中有效态铁、铝和锰的浓度采用电感耦合等离子体质谱仪测定。土壤粘粒含量和阳离子交换量分别采用沉降法和非缓冲硫脲银法测定。

1.2.3 植物毒性测试

大麦根伸长毒性试验参照国际标准组织ISO 11269-1[16]的方法，称取120 g土壤样品装入培养大麦根长的PVC圆筒管(底部留有透气小孔，底部直径4.2 cm，筒高12 cm)，维持土壤60%的最大田间持水量于人工气候箱中平衡7 d，气候箱白天温度保持22 ℃，设定为14 h，夜间温度保持18 ℃，设定10 h，光照强度设定为24 000 lux·m-2。每天称重圆筒培养管，通过添加去离子水保持其60%的田间持水量。土壤培养7 d后，将已在培养皿中培育36 h的胚根根长<2 mm的大麦种子播种到土壤中，每个筒内6颗种子。5 d后，从筒内取出大麦并用清水冲洗干净，测量并记录大麦次根长的值然后求3个重复的平均值。最后计算不同Cr(Ⅵ)浓度处理下的相对根伸长(RE)(%)，公式如下：

式中：REt为添加8个不同Cr(Ⅵ)浓度处理下大麦根伸长；REc为空白对照的大麦根伸长。

1.3 数据统计

(1)外源Cr(Ⅵ)对大麦根长毒性效应采用对数-对数剂量效应曲线(log-logistic)进行拟合[17]，计算公式如下：

(1)

式中：Y表示大麦相对根伸长(%)，X为土壤中添加Cr(Ⅵ)的浓度(mg·kg-1)；Y0、b和M为曲线的拟合参数，M为毒性阈值(EC10和EC50)，EC50和EC10分别表示大麦相对根长减少50%和10%时所对应的土壤Cr(Ⅵ)浓度。毒性阈值越大则意味着Cr(Ⅵ)的毒性越小。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soils

(2)大麦根长的低剂量刺激作用由低剂量毒物刺激效应(Hormesis)曲线拟合[18]，计算公式如下：

(2)

式中：Y表示大麦相对根伸长(%)；x为土壤中添加Cr(Ⅵ)的浓度(mg·kg-1)。a、b、c、d和k为拟合参数，当k为10或50时，参数c便为毒性阈值EC10或EC50的值。毒性阈值EC10和EC50可以通过该曲线拟合获得，其95%的置信区间采用Tablecurve 2D V 5.01软件计算。

采用软件SPSS 24.0进行土壤性质与大麦毒性阈值的相关性及回归分析，利用Origin Pro 8.5作图。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 Cr(Ⅵ)的剂量-效应关系和毒性阈值

通过log-logistic模型(式(1))对土壤Cr(Ⅵ)浓度与大麦毒性响应进行剂量-效应关系拟合和毒性阈值的预测，结果如图1和表2所示。在个别土壤类型上(吉林公主岭、河北石家庄、陕西杨凌和河北廊坊)发现，当添加低剂量的Cr(Ⅵ)时，对大麦根伸长产生刺激效应，其中，以石家庄和廊坊最为明显，根伸长最大值分别达到了对照的129.5%和122.5%，因此，这4种土壤的Cr(Ⅵ)浓度与大麦毒性响应采用刺激效应曲线拟合(式(2))，结果如图1和表2所示。由此可知，随着外源Cr(Ⅵ)添加量的增大，大麦相对根伸长逐渐减小，并且不同理化性质的土壤中Cr(Ⅵ)对大麦根伸长的毒性阈值差异很大，其EC50值变化范围为8.27～241.34 mg·kg-1，EC10值为2.87～124.65 mg·kg-1，EC50和EC10最大值和最小值分别差了29.2倍和43.4倍，其中，EC50和EC10最大的为海南的酸性土壤(pH 4.93)，最小的为郑州的碱性土(pH 8.86)。

2.2 影响土壤中Cr(Ⅵ)毒性的土壤性质因子及其预测模型

利用SPSS 24.0软件分析了土壤理化性质(表1)与Cr(Ⅵ)对大麦根伸长毒性阈值(EC50和EC10)(表2)之间的Pearson相关关系，结果如表3所示。由表3可知，铁氧化物含量、铝氧化物含量、pH值和有机碳含量与EC50、EC10显著相关(P<0.05)，其中，土壤pH值与EC50和EC10呈负相关关系，其相关系数分别为-0.647、-0.577；而土壤有机碳含量和铁、铝氧化物含量分别与EC50、EC10呈显著正相关关系。土壤粘粒含量、电导率、阳离子交换量及锰氧化物含量与Cr(Ⅵ)的毒性阈值相关不显著。

图1 11种土壤中Cr(Ⅵ)对大麦根伸长的剂量-效应曲线Fig. 1 Dose-response curve of Cr(Ⅵ) to the barley root-growth in 11 soils

选择表3中具有相关关系的因子与大麦毒性阈值进行逐步线性回归，从而建立了一元和多元回归方程(表4)。由表4可知，铝氧化物含量为控制EC50值最重要的单一因子(R2=0.448，P<0.05)，其次为土壤pH值和有机碳含量，二者共解释了65.7%的模型变异，当进一步引入第4个因子铁氧化物含量时，模型变异系数由65.7%提升到了70.1%。对于EC10而言，铁、铝氧化物含量为最显著的影响因子，分别解释了42.9%、42.4%的变异，当方程逐步引入其他相关因子时，可以不断提高模型的预测能力，在引入pH值后，决定系数(R2)从0.429增加到0.604(表4中方程5～8)。

11种土壤中Cr(Ⅵ)对大麦根伸长毒性阈值实测值与预测值之间的相关关系如图2所示(表4中方程4和方程8)，结果表明，与实测值相比，除了廊坊土壤EC10外，其他土壤EC50和EC10值均位于2倍预测值范围内，说明模型能够较为准确地预测Cr(Ⅵ)对大麦的毒性。

表2 不同土壤中Cr(Ⅵ)对大麦根伸长的毒性阈值Table 2 Toxicity thresholds for Cr(Ⅵ) added to soil measured by barley root elongation in the different soils (mg·kg-1)

表3 土壤Cr(Ⅵ)毒性阈值与土壤性质的Pearson相关系数(n=11)Table 3 Pearson correlation coefficients between the toxicity threshold of Cr(Ⅵ) and the soil properties (n=11)

表4 不同性质土壤中Cr(Ⅵ)毒性阈值的预测模型(n=11)Table 4 Predicted models of the Cr(Ⅵ) toxicity threshold of soils with different properties (n=11)

图2 土壤中Cr(Ⅵ)毒性阈值实测值和预测值之间的相关关系注：实线代表1∶1的回归线，虚线代表2倍的预测区间；空心点为本实验数据，实心点为文献[4]的土壤数据。Fig. 2 Relationship between the measured toxicity threshold of Cr(Ⅵ) and the predicted value in soilsNote: The solid lines indicate 1∶1 regression lines, and the dotted lines indicate double prediction intervals; the hollow points represent the data from this experiment, and the solid points are obtained as the soil data from literature [4].

3 讨论(Discussion)

3.1 土壤中六价铬的植物毒性

本实验利用植物根伸长为评价终点测试了Cr(Ⅵ)对大麦的毒性。作为一种标准测试方法，植物根伸长已被广泛用于Cu、Ni、Co和Mo等元素的毒性评价，其毒性数据也被应用于相关标准的制定[6-10]。大麦对Cr(Ⅵ)毒害的响应研究也表明，其根长比其他部分更敏感。例如，王晓南等[19]通过土壤中Cr(Ⅵ)对8种植物的毒性试验研究发现，植物根伸长对Cr(Ⅵ)的敏感性显著高于种子发芽。

本研究得出了11种土壤中Cr(Ⅵ)对大麦毒性的阈值EC50和EC10，这和以往在相似性质的土壤中得出的Cr(Ⅵ)对大麦毒性的结果类似。例如，付平南等[4]采用相似的方法测试了我国8种土壤中Cr(Ⅵ)对大麦毒性效应，得出的EC50和EC10的范围分别为8.0～126.6 mg·kg-1和1.7～75.1 mg·kg-1，最大值和最小值分别相差15.8倍和44.2倍。彭叶棉等[13]以小麦为供试植物研究6种不同土壤中外源Cr(Ⅵ)的毒性，得出的毒性阈值EC50为18.5～137.5 mg·kg-1，EC10为10.4～80.8 mg·kg-1，最大值和最小值分别相差7.4倍和7.8倍。但相比付平南等[4]和彭叶棉等[13]的结果，本实验得出的阈值范围变化更大，11种土壤中毒性阈值EC50和EC10分别相差了29.2倍和43.4倍，这主要和本研究涉及到的土壤样品多，土壤理化性质差异大有关。

3.2 土壤性质对Cr(Ⅵ)植物毒性的影响

研究结果表明，土壤理化性质对大麦Cr(Ⅵ)毒性影响显著，铁、铝氧化物含量、pH值和土壤有机碳含量是影响土壤Cr(Ⅵ)对大麦毒性的最重要因子。其中，铁、铝氧化物含量影响最为明显，这与Cu、Zn和Ni等元素明显不同，其主要原因是土壤中Cr的吸附-解吸在很大程度上受铁、铝氧化物的影响。土壤中的铁、铝氧化物通常带有丰富的正电荷，而Cr(Ⅵ)在土壤中以阴离子形式存在[15]，因此，在铁、铝氧化物含量较高的土壤对Cr(Ⅵ)的吸附能力也很强，从而会导致Cr(Ⅵ)的生物有效性降低，毒性减小，而Cu、Zn和Ni在土壤中以阳离子存在，其毒性主要受土壤pH值、CEC等影响。以往研究也表明，铁氧化物会改变Cr在土壤中的赋存形态,使其向更稳定的铁锰结合态转变,从而降低Cr在环境中的迁移性，减少植物对Cr(Ⅵ)的吸收[20-22]。

除铁、铝氧化物含量外，本研究还发现，土壤pH值和有机碳含量也是影响土壤中Cr生物有效性和毒性的重要因素。相关分析表明，土壤pH值和Cr(Ⅵ)毒性阈值呈显著负相关。尽管pH值也影响Cu、Zn和Ni等重金属毒性阈值[23]，但影响规律与Cr(Ⅵ)相反。pH值主要通过影响Cr的氧化还原来影响其植物毒性。据报道，在酸性土壤条件下，Cr(Ⅵ)较易发生还原反应而形成Cr(Ⅲ)沉淀；在碱性条件下，Cr(Ⅲ)又容易转化为Cr(Ⅵ)，同时Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)过程的反应速率随着pH值的降低而增加[24-25]，而土壤中Cr(Ⅵ)的毒性要强于Cr(Ⅲ)，因此，Cr在pH值较高的土壤中的毒性要强于低pH值土壤。Martí等[26]的研究表明，在pH为8.0的碱性土壤条件下，Cr(Ⅵ)对植物的EC50为13 mg·kg-1，而在pH为5.8的酸性土壤中EC50高达153 mg·kg-1。土壤有机碳含量则主要通过干预Cr的氧化还原反应与改变土壤对Cr(Ⅵ)吸附能力来影响Cr(Ⅵ)的植物毒性。一方面有机碳作为电子供体可以将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，从而导致价态发生变化[27]，另一方面土壤中有机碳含量越高，对Cr(Ⅵ)的吸附能力也越强，更容易将Cr固定于土壤中[28]。因此，土壤有机碳含量越高，Cr对大麦的毒性越低，其他研究中也发现类似的规律，如Chen等[29]基于XANES光谱评估Cr(Ⅵ)的植物毒性，发现有机质含量高的土壤中，Cr(Ⅵ)被完全还原为Cr(Ⅲ)；Choppala等[30]的研究表明，通过增加有机碳可以增强污染土壤中土壤颗粒对Cr的吸附，从而减轻土壤中Cr的生物毒性。

3.3 Cr(Ⅵ)植物毒性与土壤性质的回归模型

本研究建立了土壤外源Cr(Ⅵ)对大麦毒性阈值的一元和多元线性回归模型。为了验证模型准确性，利用本研究建立的回归模型预测了付平南等[4]在8种性质不同的土壤中得到的Cr(Ⅵ)对大麦的毒性阈值，其研究涉及的pH值和有机碳含量分别从6.0到8.1、0.1%到1.9%。由于付平南等[4]的研究中没有铁、铝氧化物含量数据，所以只代入表4中的方程3，结果表明，本研究的回归方程能够较好地预测土壤外源Cr(Ⅵ)的植物毒性阈值(R2=0.724，P<0.05)，除1个点稍大于2倍范围，其他的预测值均在2倍阈值范围之内(图2)。

尽管模型能较好地预测土壤Cr(Ⅵ)对大麦毒性阈值，但同类似土壤条件下得出的Cu、Ni模型相比，Cr最优模型体现了影响因子多、解释的变化程度相对较小的特点，表明土壤中Cr(Ⅵ)植物毒性是一个多因素影响的、综合和复杂的过程，今后的研究还需进一步了解Cr在土壤的吸附解吸、氧化还原、沉淀和溶解等机制，掌握其在土壤的迁移转化和植物毒性规律。