杨嘉辉，王安,*，杨秀鸿

1. 中南大学湘雅公共卫生学院卫生毒理学系，长沙 410078 2. 湖南省职业病防治院毒理实验室，长沙 410007

除草剂(herbicide)主要被用于农业及非农业中杂草及有害植物的杀灭或防治，已逐渐成为农业生产中至关重要的工具。而因药害、残留性、污染性、杂草抗药性及毒性等问题，一些除草剂渐渐被更加高效安全的产品取代。本文所涉及的22种除草剂及其主要施用场景如表1所示。

除草剂可随水循环及食物链在不同生态系统中的生物间传递，目标杂草以外的生物即为非靶标生物(non-target organism)。其中适宜的物种可作为除草剂生殖及遗传毒性研究的模式生物(model organism)。生殖毒性(reproductive toxicity)又称繁殖毒性，是指外源性化学物引起的亲代雌性或雄性繁殖功能损伤或生殖能力下降；遗传毒性(genotoxicity)则是外源化学物对遗传物质的毒性作用。传统的生殖毒性研究多以大鼠和小鼠等啮齿类动物为试验对象，往往因效率、周期和成本问题而无法满足现实的研究需要；而经典的遗传毒性试验也大多无法真实地反映生态系统中生物遗传物质所受的损害。随着研究技术的发展和伦理学方面的要求，鸟类、鱼类、两栖动物、爬行动物等脊椎动物，以及节肢动物、线虫动物等无脊椎动物在生殖和遗传毒性安全评价中获得了一定的青睐。本文综述了多种常见除草剂对一些非靶标生物以及人体的生殖毒性和遗传毒性作用，希望能为除草剂的生态毒理研究提供思路，为新品类除草剂毒性试验中模式生物的选择提供参考。

表1 文中涉及的除草剂及其施用场景Table 1 Herbicides studied in this article and their application

1 鱼类与鸟类(Fish and birds)

1.1 鱼类

除草剂可通过水体由农田生态系统向水生生态系统转移，并通过食物链向上传递，对其中的鱼类造成毒害作用[1]。研究显示，一些除草剂可影响鱼类的类固醇合成相关基因的表达，干扰睾酮及雌二醇等性激素的分泌，从而对生殖产生不利影响。Uren等[2]以0.01、0.5和10 mg·L-1的草甘膦对繁殖期的斑马鱼染毒21 d。在10 mg·L-1的剂量下，雌性斑马鱼的受精率不受影响，而产卵量降低，胚胎早期死亡及早产的发生率升高。性腺基因转录表达谱显示，在10 mg·L-1的剂量下，草甘膦可使雄性斑马鱼睾丸中过氧化氢酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、hsd3b2及雌性斑马鱼卵巢中cyp19a1和ersl的表达上调。Armiliato等[3]发现，65 μg·L-1草甘膦染毒15 d可诱导雌性斑马鱼的类固醇生成因子-1表达上调，并引起卵母细胞直径增大及卵巢超微结构异常。Zhu等[4]研究发现，精喹禾灵对斑马鱼的48 h半数致死浓度(LC50)为1.21 mg·L-1，据此设立剂量为2、20和200 μg·L-1，染毒30 d后检测发现精喹禾灵可通过调节斑马鱼体内卵黄蛋白原1(vitellogenin1, VTG1)、雌激素受体α(estrogen receptorα, ERα)、hhex和pax8等分泌相关的基因表达而影响生殖。雄鱼体内下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic pituitary gonadal, HPG)轴的相关基因表达上调，卵黄蛋白原(vitellogenin, VTG)及雌激素水平升高；而雌鱼HPG轴相关的基因表达下调，VTG水平下降。此外，精喹禾灵可诱导斑马鱼性腺组织学损伤，引起胚胎孵化及生长抑制乃至畸形。Jiang等[5]以50、100和200 μg·L-1的丙草胺染毒斑马鱼96 h，发现丙草胺除通过HPG轴诱导芳香化酶活性及VTG表达增强外，还可引起凋亡途径中P53、mdm2、bbc3的表达及caspase3、caspase9活性上调，从而诱导胚胎细胞凋亡。

Richter等[6]以0.5、5和50 g·L-1的阿特拉津染毒雌性日本青鳉(Oryziaslatipes)和黑头软口鲦(Pimephalespromelas)30～38 d，发现染毒组的产卵量均有减少，VTG1及透明带糖蛋白3.1(zp3.1)等与卵成熟、卵巢中类固醇有关的物质、肝脏中雌激素受体(estrogen receptor, ER)以及大脑中促性腺激素的表达下调。Ahmadivand等[7]发现，经0.39 mg·L-1丁草胺染毒10 d的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，其血浆睾酮水平下降，性腺指数(gonadosomatic index, GSI)无显著变化；参与减数分裂的boule表达下调，减数分裂进程受抑制。Papoulias等[8]以0.5、5和50 μg·L-1的阿特拉津染毒日本青鳉，所有剂量组的雌性日本青鳉总产卵量均较对照组降低(36%～42%)，主要归因于雌性排卵数的减少以及雄性生殖细胞异常，而睾酮、雌二醇、芳香化酶蛋白水平以及性腺指数不受影响，这一结果与前述研究有所不同。

除草剂对鱼类生殖系统也可能存在直接毒性作用。Lopes等[9]利用5 mg·L-1和10 mg·L-1的草甘膦染毒雄性斑马鱼，在24 h和96 h这2个时间点采集精子，结果显示，2个剂量组精子的线粒体膜及DNA完整性均遭到破坏，精子活性降低。

在遗传毒性评价中，常用微核试验和单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)评价化学物的染色体损伤作用和DNA损伤作用。Anbumani和Mohankumar[10]以亚致死浓度(0.016、0.032和0.064 mg·L-1)的丁草胺染毒卡特拉鲃(Catlacatla)35 d，随染毒时间增加，各剂量组外周血红细胞微核率升高，并有双核细胞和无核细胞出现。Adeyemi等[11]的研究显示，0.1 mmol·L-1阿特拉津染毒96 h对斑马鱼胚胎具有致畸作用、氧化应激作用以及遗传毒性，表现为卵凝结、卵水肿、生长迟缓、脊柱侧凸、脂质过氧化水平升高、CAT活性减弱以及DNA尾矩增加。

Nwani等[12]采用半静态法测得草甘膦和阿特拉津对翠鳢(Channapunctatus)的96 h-LC50值分别为32.0 mg·L-1和42.0 mg·L-1，并以LC50值的1/4、1/2和3/4作为染毒剂量，即以草甘膦(8.1、16.3和24.4 mg·L-1)及阿特拉津(10.6、21.2和31.8 mg·L-1)染毒翠鳢96 h，每隔24 h采集外周血，微核试验显示各剂量组外周血红细胞微核率均升高，在96 h达最高值，并出现核碎裂和双核等核异常现象。Piancini等[13]以环境相关浓度(1.8、7、30、115和460 μg·L-1)的硝磺草酮分别处理尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)和巴西珠母丽鱼(Geophagusbrasiliensis)96 h，在各染毒组中均可观察到氧化应激和DNA损伤，尼罗罗非鱼体内谷胱甘肽(glutathione, GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)水平升高；巴西珠母丽鱼体内谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性增加，SCGE结果显示肝脏、外周血淋巴细胞及腮组织存在DNA损伤。Wang等[14]以环境相关浓度(1.8、18和180 μg·L-1)的硝磺草酮处理锦鲤(Cyprinuscarpio)，在7、18和28 d收集鳃、肝脏和肌肉组织，SCGE检测显示各剂量组均出现DNA损伤，以肝脏最甚，仅第28天时在180 μg·L-1剂量组中观察到SOD、CAT和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高，而丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、GSH、GPx及谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GSR)活性无显著变化。Ruiz等[15]以2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和麦草畏的亚致死浓度，即96 h-LC50值的2.5%和5%(2,4-D为25.2 mg·L-1和50.4 mg·L-1，麦草畏为41 mg·L-1和82 mg·L-1)分别染毒花鳉(Cnesterodondecemmaculatus)28 d，2,4-D可在7～28 d时诱导原发性DNA损伤，而2种剂量的麦草畏分别在7～14 d和7～28 d内诱导原发性DNA损伤，损伤表现为DNA链的断裂。

1.2 鸟类

畜牧业与种植业同为农业的组成部分，在空间分布上较为接近，故家禽容易暴露于除草剂等农药中。Somers等[16]早在1978年便以鸡为对象进行了除草剂一代和二代繁殖试验，2,4-D、2,4,5-涕(2,4,5-T)及氨氯吡啶酸的推荐田间施用量为746 L·hm-2，稀释后通过喷雾形式使公鸡与母鸡分别暴露于10倍推荐施用量(11.2 kg·hm-2)，以人工授精技术得到胚胎并进行孵化，发现该剂量下交配成功率、胚胎的死亡率及畸形率无显著变化，子代的生长发育及生殖未受影响。Arias[17]根据8 mg·胚胎-1的半数致死剂量(LD50)值，按0、0.5、1、2和4 mg的剂量向鸡卵壳膜内注射2,4-D，在染毒第4、7和10天进行姐妹染色单体互换(sister-chromatid exchange, SCE)和细胞周期动力学方面的检测，除0.5 mg以外的剂量组中均观察到了鸡胚SCE率升高及细胞周期减慢，提示2,4-D对鸡胚具有一定的遗传毒性，其最低可观测效应浓度(lowest observed effect concentration, LOEC)为1 mg·胚胎-1，远超过推荐田间施用量。靳生等[18]测得阿特拉津对雏鸡的LD50为451 mg·kg-1体质量，并以LD50的1/20、1/15和1/10设置剂量组，通过微核试验发现阿特拉津对雏鸡具有致突变作用，可诱导雏鸡骨髓嗜多染红细胞微核率升高，呈剂量依赖性，LOEC为22.55 mg·kg-1体质量。

de la Casa-Resino等[19]在第0、5和10天以阿特拉津染毒雌性欧洲鹌鹑(Coturnixcoturnixcoturnix)，剂量为25 mg·kg-1和100 mg·kg-1，并在第15、30和45天取样，在第30天时2种剂量下均可引起肝脏ERα表达上调，血浆雌二醇水平升高；100 mg·kg-1剂量下可引起血清VTG浓度升高，低于美国环境保护局给出的未观察到有害作用浓度(no observed adverse effect concentration, NOAEC)225 mg·kg-1体质量，提示阿特拉津具有雌激素作用，可干扰雌性鹌鹑HPG轴的激素调节。Soni等[20]通过静脉注射染毒日本鹌鹑(Coturnixcoturnixjaponica)1周，剂量为10 mg·kg-1体质量，发现百草枯可作用于光感受器和HPG轴，使视紫红质、黑视蛋、类固醇、雄激素受体(androgen receptor, AR)和促性腺激素释放激素-I(gonadotropin-releasing hormone-I, GnRH-I)表达下调，而使褪黑素受体(MEL-1A-R、MEL1BR、MEL1CR)和促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)表达上调，从而影响日本鹌鹑的生殖功能。李薇[21]的研究显示，阿特拉津及其细胞代谢产物二氨基氯三嗪(diaminochlorotriazine, DACT)可抑制鹌鹑卵巢颗粒细胞活性，诱发氧化应激，诱导性激素合成相关蛋白及cAMP表达上调，从而引起卵巢颗粒细胞内分泌紊乱，阿特拉津的半数抑制浓度(IC50)为(261.20±1.88) μmol·L-1，DACT的IC50为(214.17±2.98) μmol·L-1。

2 两栖动物与爬行动物(Amphibians and reptiles)

2.1 两栖动物

随着农业生产中除草剂的应用，以水稻田生态系统为栖息地的两栖动物染毒的隐患逐渐增大。Lajmanovich等[22]研究了草甘膦、甲磺隆、双草醚和氨氯吡啶酸4种除草剂对蟾蜍(Rhinellaarenarum)蝌蚪的遗传毒性，4种除草剂均可抑制蝌蚪体内乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)活性；除草甘膦外，甲磺隆、双草醚和氨氯吡啶酸可引起蝌蚪核异常率升高。

镇海林蛙(Ranazhenhaiensis)、黑眶蟾蜍(Bufomelanostictus)和泽陆蛙(Fejervaryamultistriat)是我国南方稻田常见蛙类，以0.2、0.4、1.0和1.5 mg·L-1剂量的丁草胺处理镇海林蛙的蝌蚪，以0.2、0.4、0.6和0.8 mg·L-1剂量的丁草胺处理黑眶蟾蜍和泽陆蛙的蝌蚪，染毒第1、2、3和4天收集蝌蚪血细胞。微核试验结果表明，随染毒时间增加，各剂量组蝌蚪红细胞的微核率及核异常率逐渐升高，第3天达峰值，第4天降至对照水平，0.2 mg·L-1和0.4 mg·L-1的剂量下微核率及核异常率的升高不具有统计学意义。SCGE检测结果显示，0.2 mg·L-1丁草胺即可引起3种蝌蚪的DNA损伤，随浓度升高DNA损伤水平升高[23]。叶圣涛[24]以泽陆蛙和黑斑侧褶蛙(Pelophylaxnigromaculata)为对象，以0.025、0.05、0.1和0.25 mg·L-1终浓度的乙草胺和丁草胺处理其血液，SCGE检测结果显示，0.025 mg·L-1的乙草胺和丁草胺即可引起红细胞DNA损伤，损伤水平呈剂量依赖性；以2、8和32 mg·L-1终浓度的乙草胺和丁草胺染毒个体，微核试验结果显示，2 mg·L-1丁草胺即可引起泽陆蛙红细胞微核率升高，不同剂量组间无差异；各剂量组乙草胺均不引起泽陆蛙红细胞微核率变化。2 mg·L-1的乙草胺或丁草胺即可诱导黑斑侧褶蛙的红细胞微核率升高，表现出剂量效应关系。Liu等[25]发现，丁草胺在环境浓度下对泽陆蛙蝌蚪的生存、发育及变态过程存在不利影响，其96 h-LC50为0.87 mg·L-1，远低于稻田推荐施用量4.8 mg·L-1，以0.2、0.4和0.8 mg·L-1的丁草胺染毒泽陆蛙蝌蚪35 d，SCGE检测结果显示0.4 mg·L-1和0.8 mg·L-1剂量组蝌蚪红细胞出现DNA单链断裂等DNA损伤。恶唑禾草酸(fenoxaprop acid, FA)和6-氯苯并恶唑酮(6-chloro-2-benzoxazolone, CDHB)是恶唑禾草灵的2种主要代谢产物。Jing等[26]通过经口和经皮的途径给予青蛙恶唑禾草灵，经口染毒后在其体内未检出恶唑禾草灵，但在肝脏、肾脏、大脑、卵、皮肤、肌肉和血液组织中可检出FA；经皮染毒后在体内检测不到恶唑禾草灵及代谢产物。仅CDHB具有明显的急性毒性，96 h-LC50为30.4 μg·mL-1。蝌蚪外周血红细胞微核试验结果显示，仅在最高剂量组(10 mg·L-1)中，CDHB以及FA的S-异构体和R-异构体均表现出了遗传毒性，染毒96 h后微核率分别为对照组的1.7倍、2.4倍和2.8倍。

阿特拉津作为一种内分泌干扰物，对两栖类动物的生殖存在不利影响，在欧洲一些国家已逐渐被其他除草剂所取代。阿特拉津可上调或下调非洲爪蟾(Xenopuslaevis)环状RNA(circRNA)以及长链非编码RNA(IncRNA)的表达，受阿特拉津影响的RNA主要涉及19条通路[27-28]，这些信号通路与NOD样受体、紧密连接、过氧化物酶体增殖物激活受体、黏附连接、甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成有关。m6A修饰与mRNA丰度呈正相关，提示m6A可能与两栖类睾丸发育有关[29]；Hayes等[30]通过2.5×10-3mg·L-1阿特拉津乙醇溶液处理40只雄性爪蟾，染毒期包括了爪蟾幼体期及变态后3 a。方差分析显示，与溶剂对照组相比，阿特拉津可诱导雄性爪蟾的雌性化，引起睾酮水平降低，生殖腺萎缩，精子生成减少，交配行为抑制及生育能力下降。染毒组中10%的雄性爪蟾具有雄性基因和雌性功能，可与未暴露组的雄性交配产生可存活的卵。这一剂量水平远低于美国中西部降水中检测出的水平(0.1 mg·L-1)。模拟环境中阿特拉津的浓度，以0、0.1、1和10 μg·L-1的剂量对繁殖期的成年蟋蟀蛙(Acrisblanchardi)进行染毒，发现0.1 μg·L-1和10 μg·L-1剂量组中雄性个体比对照组分别少51%和55%，即阿特拉津可引起蟋蟀蛙的性别比例失衡，使正常族群中偏向男性的性别比转为偏向女性，但未发现睾丸卵等性腺结构异常情况，染毒组繁殖率及产蝌蚪数量与对照组无显著差异[31-32]。Gonçalves等[33]以2.25、4.5、9和18 mg·L-1的阿特拉津对金色小树蛙(Dendropsophusminutus)染毒96 h，并观察不同发育阶段的遗传毒性。SCGE检测结果显示，各剂量组在前变态期(Gosner发育阶段25～33期)及变态后期(Gosner发育阶段42～43期)均出现了DNA损伤，呈剂量依赖性。18 mg·L-1剂量的阿特拉津可诱导变态期(Gosner发育阶段36～39期)的DNA损伤，但无剂量反应关系。微核试验结果显示，各发育阶段均出现微核率的升高，与DNA损伤程度呈正相关。

2.2 爬行动物

爬行动物不仅在陆地生态系统中广泛分布，龟科和鳄科爬行动物也存在于水生生态系统中。一些除草剂可干扰爬行动物的内分泌系统，Vonier等[34]针对美洲短吻鳄(Alligatormississippiensis)的研究显示，甲草胺及阿特拉津可与17β-雌二醇竞争ERα，从而抑制雌二醇与受体的结合，IC50分别为20.7 μmol·L-1和27.5 μmol·L-1。Bicho等[35]以葡萄牙西北部玉米田中捕获的37只雄性蜥蜴(Podarcisbocagei)为对象，以协方差分析(overview of analysis of covariance, ANCOVA)法分析实验数据，发现与甲草胺非暴露区域的蜥蜴相比，甲草胺暴露区域蜥蜴的甲状腺激素受体表达上调，甲状腺滤泡面积增大(ANCOVA:F=6.9,P=0.02)；睾丸生精小管直径有所增大(ANCOVA:F=4.5,P=0.04)，生精细胞层数显著减小(ANCOVA:F=9.1,P=0.005)。

也有研究利用爬行动物的卵进行遗传毒性试验。Schaumburg等[36]以50、100、200、400、800和1 600 μg·卵-1剂量的草甘膦染毒阿根廷黑白泰加蜥(Salvatormerianea)的卵，未观察到致畸作用。各剂量组的微核率及核异常率与对照组相比无显著差异，剂量高于100 μg·卵-1时DNA损伤作用显著增加。Burella等[37]利用草甘膦染毒宽吻凯门鳄(Caimanlatirostris)的卵。宽吻凯门鳄卵的孵化期可分为3个阶段，每个阶段约23 d，各阶段染毒剂量分别为750、1 250和1 750 μg·卵-1，与对照组相比，微核率及核异常率无显著变化，SCGE检测结果显示750 μg·卵-1浓度下即出现DNA损伤，各剂量组与对照组间差异具有统计学意义，而各暴露阶段间无显著性差异。

3 节肢动物与软体动物(Arthropoda and mollusks)

3.1 节肢动物

溞是水体食物链中关键的一环，而除草剂对溞的生殖存在不利影响。草甘膦对大型溞(Daphniamagna)的毒性为低毒，其48 h-LC50为151.057 mg·L-1。21 d慢性毒性试验结果显示，草甘膦可使大型溞产幼溞的胎数以及数量减少，21 d-LOEC为3.125 mg·L-1，无可观测效应浓度(no observed effect concentration, NOEC)为1.56 mg·L-1；25 mg·L-1剂量下首次产幼溞时间延后[38]；草甘膦和氰氟草酯对隆线溞(Daphniacarinata)的24 h-LC50分别为66.58 mg·L-1和63.15 mg·L-1，以LC50的1/20和1/10设立剂量组进行染毒，3.33 mg·L-1草甘膦及3.16 mg·L-1氰氟草酯即可引起隆线溞初产龄延后，雄溞百分率增加，幼溞死亡率及母溞产后死亡率升高[39]。

蟹类常被用于评价污染物对水生态系统影响。Canosa等[40]通过体内实验发现，1 mg·L-1剂量的草甘膦染毒30 d可使颗粒新厚蟹(Neohelicegranulata)体质量增量、肌肉蛋白质水平降低，并通过干扰雄激素的分泌和转导而抑制精子发生，导致输卵管的精包中精子数显著减少，精包的异常率升高。体外实验中，输精管与雄激素腺共孵育时，后者可使精子及精包数量增加，而在加入1 mg·L-1草甘膦后这一趋势完全逆转。

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是一种在我国分布广泛的淡水蟹类，也是我国研究者选用较多的模式生物。王海玲[41]以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1剂量的阿特拉津染毒中华绒螯蟹，结果显示，0.1 mg·L-1阿特拉津可诱导中华绒螯蟹的精子组蛋白H3及H4表达上调，H3K79甲基转移酶基因edot1l-1和edot1l-2表达下调，以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性升高；0.001 mg·L-1剂量组中即观察到DNA受损的精子，其占比随着剂量升高而增加。朱杰[42]以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1剂量的阿特拉津染毒中华绒螯蟹，SCGE检测结果显示0.1 mg·L-1和1 mg·L-1剂量组出现DNA条带弥散；经TUNEL检测发现1 mg·L-1剂量组中DNA损伤程度高于对照；免疫荧光检测结果显示，各剂量组生精细胞中出现γ-H2AX蛋白，呈剂量依赖性；经流式细胞仪检测发现，与对照组相比，1 mg·L-1剂量组的活细胞比例下降58.47%，死细胞比例升高27.30%，即阿特拉津对中华绒螯蟹生精细胞具有毒性作用。刘欢[43]同样采用了0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1的剂量设计，但未观察到阿特拉津对中华绒螯蟹生精细胞的毒性作用，0.001 mg·L-1阿特拉津即可破坏精子染色质超微结构，导致形态异常，呈剂量依赖性。穆淑梅[44]发现，阿特拉津对中华绒螯蟹的96 h-LC50为>181 mg·L-1，以0.001、0.01、0.1和1 mg·L-1的剂量染毒1岁龄中华绒螯蟹90 d，0.001 mg·L-1剂量组中，卵巢中可观察到闭锁卵母细胞；雄性血清睾酮水平下降，雌性血清中雌二醇及孕酮水平上升，随剂量升高而程度加剧；0.01 mg·L-1剂量组雌性血清中孕酮水平下降；0.1 mg·L-1和1 mg·L-1剂量组中精子顶体反应率受抑制，随作用时间延长程度加剧；SCGE检测未观察到精子核DNA损伤。

此外，阿特拉津对雌性日本沼虾的24 h、48 h、72 h和96 h-LC50分别为134.23、90.24、52.57和46.36 mg·L-1，安全质量浓度(safe concentration, SC)为4.64 mg·L-1，32.0 mg·L-1剂量下卵母细胞出现细胞间隙增大及胞体变性，程度随剂量增大而加剧；阿特拉津对日本沼虾卵巢LDH具有毒物兴奋效应，在低于0.46 mg·L-1剂量下可诱导提高LDH活性，而高于0.46 mg·L-1时显著抑制LDH活性并表现出剂量效应关系[45]。

3.2 软体动物

Druart等[46]测定了施用Bypass®和Reglone®-Agral®(R-A)混合物后土壤的预测环境浓度，其中，草甘膦、敌草快和壬基酚的含量分别为3、1.3和0.6 mg·kg-1(土壤)。在该土壤环境以及对照土壤环境下饲养陆生蜗牛(Cantareusaspersus)并对蜗牛进行全生命周期(240 d)生物实验，方差分析实验数据，结果显示，R-A混合物和草甘膦均可促进蜗牛生长，抑制蜗牛繁殖。机制研究表明，R-A混合物可导致雄性蜗牛生殖器外翻，大幅减少交配次数，并延迟雌性蜗牛产卵期20 d；草甘膦可阻碍外环境中蜗牛卵的受精过程，导致生育率的降低。Wilson等[47]利用吡草酮(浓度为1.2～60 mg·L-1)染毒水生蜗牛(Isidorellanewcombi)24 h，并在之后的21 d内监测产卵量和粪便量，发现各剂量组的蜗牛产卵量和粪便量均较对照组有所下降，但差异无统计学意义。Baurand等[48]的研究显示，草甘膦对陆生蜗牛胚胎孵化的半数效应浓度(EC50)为29.02 mg·L-1。通过随机扩增多态DNA(PARD)和高分辨率毛细管电泳系统(HRS)检测了陆生蜗牛胚胎的基因，30 mg·L-1草甘膦染毒的胚胎中观察到了谱带的消失及新扩增产物的出现，提示胚胎出现了DNA损伤和寡核苷酸启动位点的变化，该剂量远低于推荐葡萄园田间施用量(5 140 mg·L-1)。

Mai等[49]以法国西南部阿卡洪湾的太平洋牡蛎(Crassostreagigas)为对象，以0.01、0.1、1和10 μg·L-1的异丙甲草胺染毒24 h，以海水为对照，DNA损伤本底值为(9.56±0.59)%，非畸胎率为(79.03±2.6)%，0.01 μg·L-1剂量组中，幼体的畸形率及DNA单链断裂率即显著高于对照，并随剂量增大而升高，10 μg·L-1时分别达到47.4%和18.3%，且二者存在正相关关系(r2=0.71)；精异丙甲草胺(S-metolachlor)及其代谢产物异丙甲草胺乙烷磺酸(metolachlor ethane sulfonic acid, MESA)和异丙甲草胺苯甲酸(metolachlor oxanilic acid, MOA)染毒24 h后，0.01 μg·L-1的精异丙甲草胺及0.1 μg·L-1的MESA和MOA可引起太平洋牡蛎幼体畸形率及DNA损伤率升高，代谢产物的胚胎毒性和遗传毒性较原药弱；0.01 μg·L-1的精异丙甲草胺、0.01 μg·L-1的MOA及1 μg·L-1的MOA可引起雄性牡蛎的精子损伤，其机制与异丙甲草胺和MESA引起氧化应激反应相关蛋白(线粒体SOD和CAT)基因转录水平的变化有关[50]。Mantecca等[51]发现百草枯对斑马贻贝(Dreissenapolymorpha)具有细胞毒性和遗传毒性，以0.125、0.25和0.5 mg·L-1的百草枯染毒斑马贻贝，0.25 mg·L-1和0.5 mg·L-1剂量下可观察到睾丸细胞空泡化、细胞溶解及生发上皮变薄等组织病理学变化，微核试验结果显示，贻贝红细胞的微核自发率为2.75%～0.425%，而染毒组的微核率升高，为3.5%～1.25%。

4 环节动物与线虫(Annelida and nematoda)

4.1 环节动物

蚯蚓在土壤生态系统中的生物量占比最大，具有位于食物链底端以及对于毒物敏感的特点，适合作为检测土壤污染的指示生物[52]。除草剂可通过皮肤及消化系统进入蚯蚓体内。Li等[53]的研究显示，10 mg·kg-1的硝磺草酮可诱导赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)体内的氧化应激，SOD、CAT及过氧化物酶(peroxidase, POD)的活性降低，MDA含量显著增加；SCGE检测结果显示10 mg·kg-1的硝磺草酮可引起赤子爱胜蚓的DNA损伤，程度随时间和剂量增加而加剧。Hackenberger等[54]研究了草甘膦、环磺酮和烟嘧磺隆对蚯蚓(Dendrobaenaveneta)的影响。草甘膦、环磺酮和烟嘧磺隆的环境浓度为2 160、66和30 μg·kg-1土壤干重，剂量设置为环境浓度、1/10环境浓度及1/100环境浓度。试验观察到了3种除草剂对蚯蚓体内氧化应激状态的影响。环境浓度下的草甘膦在染毒7 d时可显著增加蚯蚓AChE活性；环境浓度下烟嘧磺隆对AChE活性无影响，而在较低的剂量(1/10环境浓度)下染毒28 d可显著增加AChE活性；6.6 μg·kg-1和66 μg·kg-1剂量的环磺酮染毒7 d可诱导蚯蚓的氧化应激和神经毒性，染毒28 d时66 μg·kg-1剂量组AChE活性恢复至对照水平，而6.6 μg·kg-1剂量组保持不变。暴露28 d后，烟嘧磺隆3 μg·kg-1和30 μg·kg-1剂量组中蚯蚓的繁殖量显著高于对照组；暴露56 d后，3种除草剂各剂量组中未孵化茧数均显著低于对照组。Muangphra等[55]的研究显示，草甘膦和百草枯对蚯蚓(Pheretimapeguana)的48 h-LC50分别为251.45 μg·cm-2和3.9 μg·cm-2，以LC50及其1/10、1/100、1/1 000和1/10 000设立剂量组，微核试验结果显示，在≥0.25 μg·cm-2的草甘膦剂量组和≥39×10-5μg·cm-2的百草枯剂量组中，蚯蚓体腔细胞的微核率、双核率及三核率总数较对照组显著升高，核异常细胞数与草甘膦或百草枯剂量的相关系数分别为0.69和0.66；SCGE检测结果显示，草甘膦无DNA损伤作用，而在≥39×10-2μg·cm-2上的百草枯剂量组中，尾部DNA百分比(TD%)和尾部长度(TL)显著高于对照组，在3.9 μg·cm-2组中，尾矩也显著增大。

4.2 线虫

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)具有子代数目多、发育过程简单以及生殖系统易于观察等特点，已在生殖毒性研究中得到广泛应用[56]。Wang等[57]的研究显示，草甘膦、铜和砷对秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别为18.5、85.1和130.5 mg·L-1，以LC50的1/1 000、1/100和1/10设立剂量组，各剂量下，草甘膦在单独应用及分别与砷或铜联合应用时均可抑制秀丽隐杆线虫的繁殖，表现出协同作用和剂量反应关系。Pristionchuspacificus(P.pacificus)线虫已作为秀丽隐杆线虫的卫星生物应用于毒理学评价中，Zhang等[58]的研究显示，乙草胺对秀丽隐杆线虫和P.pacificus的24 h-LC50及48 h-LC50分别为1 296 mg·L-1及5 400 mg·L-1、2.107 mg·L-1及1.264 mg·L-1，据此设立乙草胺剂量为0、2.5、5、10、20、40、80和160 mg·L-1，乙草胺对秀丽隐杆线虫的繁殖几乎没有抑制作用；40～160 mg·L-1剂量下P.pacificus的三代繁殖量较对照组降低。对于繁殖能力的检测，P.pacificus比秀丽隐杆线虫更为敏感。

5 人体(Human beings)

在工业生产及农业施用过程中接触除草剂的人员可能会发生职业暴露，通过分析暴露者的生物样本及暴露史资料可评价暴露与生殖遗传之间的联系。厄瓜多尔北部的农业生产者使用空中喷洒草甘膦的方式控制杂草，Paz-Y-mio等[59]通过SCGE检测了该区域内24名暴露者和21名对照者，结果显示，暴露组(彗星尾长35.5 μm)的DNA损伤程度高于对照组(彗星尾长25.94 μm)。Garaj-Vrhovac和Zeljezic[60]研究了多种除草剂的混合物(阿特拉津、甲草胺、氰草津、2,4-D)在生产过程中对工人的遗传毒性作用，以10名暴露者和20名未暴露者为对象，染色体畸变分析结果显示，暴露组染色单体和染色体断裂、双着丝粒染色体、SCE发生的频率较高；微核试验结果显示，暴露组微核率较高；SCGE检测发现染毒组的DNA迁移率较高。Barrón Cuenca等[61]对玻利维亚农业人群的调查显示，暴露于以2,4-D为主的农药混合物是DNA链断裂的危险因素(比值比(OR)=1.99)。单精子卵胞浆显微注射(ICSI)是一种人工授精技术，Al-Hussaini等[62]收集了94对接受ICSI治疗的夫妇的卵泡液样本，并检测其中农药的含量，丙草胺含量与子宫内膜厚度、获卵数、受精率及早期胚胎分裂率呈负相关，提示除草剂对ICSI产生不利影响的可能性。

除草剂对男性生殖细胞的影响也受到了研究者的关注。Swan等[63]采集了美国密苏里州和明尼苏达州农业区生育年龄男性的尿液和精子，以精液参数较低男性为病例组，以精液参数在正常范围内的男性为对照组，分析比较尿样中的除草剂浓度，发现精液参数较低者尿液中甲草胺含量较高(OR=30.0)，阿特拉津含量超出检出限(OR=11.3)，提示除草剂与男性精液质量降低有关。Lerda和Rizzi[64]对农场中32名施用除草剂的男性进行研究，与正常人群相比，其弱精子症、死精症及精子畸形症水平与尿中2,4-D代谢物水平显著升高。随暴露时间的增加，暴露者的弱精子症和死精症的水平逐渐降低，而精子畸形症的水平仍较高。Tan等[65]发现2,4-D可降低体外人类精子的总活力、前向运动力、穿透粘性介质的能力及顶体反应速率，并可阻碍孕酮诱导的获能，阻碍作用随剂量增大而增强，即2,4-D的在精浆和卵泡液的积累可能增加不育的风险。孙雪照等[66]针对农药厂男性工人的研究显示，乙草胺职业暴露对精液质量存在不利影响，与正常人群相比，职业暴露者精液量减少、精子活力减弱、精子平均路径速度(VAP)降低，精液pH值下降。Tomenson等[67]收集了美国3家工厂272名除草剂生产工人的精液样本及相关资料，分析显示禾草敌的职业暴露与工人精子水平或血清激素水平不存在相关关系，也未观察到其对生殖结局的影响。

病例对照研究可用于探索子代畸形的可疑危险因素。Ueker等[68]以巴西马托格罗索州一家医院5岁以下患儿为对象开展病例对照研究，结果显示，母亲受教育水平低(OR=8.40，95%置信区间(CI)为2.17～32.52)、父亲务农(OR=4.65，95%CI为1.03～20.98)及草甘膦等农药接触史(OR=4.15，95%CI为1.24～13.66)是子代畸形的危险因素。Meyer等[69]基于地理信息系统(geographic information system, GIS)暴露模式评估尿道下裂与施用农药之间的关系，以美国阿肯色州354例尿道下裂患儿为病例组，以727例非患儿为对照组，对妊娠6～16周期间受试者家庭500 m范围内施用农药剂量进行分类，发现孕期暴露于禾草灵与后代尿道下裂的发生呈正相关(OR=1.08，95%CI为1.01～1.15)；而孕期暴露于甲草胺则与后代尿道下裂的发生呈负相关(OR=1.08，95%CI为1.01～1.15)。Arbuckle等[70]对加拿大安大略省农场的人群研究显示，孕前的草甘膦(OR=1.7，95%CI为1.0～2.9)及硫代氨基甲酸酯类除草剂(OR=1.8，95%CI为1.1～3.0)的暴露史是孕晚期自然流产的危险因素。Weselak等[71]收集了加拿大安大略省农场家庭的数据，logistic二次回归分析结果显示，母亲孕前暴露于氰草津(OR=4.99，95%CI为1.63～15.27)和麦草畏(OR=2.42，95%CI为1.06～5.53)与男性后代出生缺陷的风险增加有关。

6 展望(Prospects)

模式生物的定义已不再局限于遗传学和发育生物学研究中所采用的物种，随着模式生物所涵盖的范围逐渐扩大，自然界中越来越多的物种被用于毒理学研究中。除草剂的生殖和遗传毒性研究所采用的模式生物，往往也是自然界中受到除草剂影响的非靶标生物，它们在生态系统中的分布以及在食物链中的地位有所区别，接触除草剂的机会及程度也有所不同。现有的研究多是采用点评估法(point-estimate approaches)，通过前期试验获得的急性毒性资料设立染毒剂量，往往不能真实反映生态系统中该生物的除草剂暴露水平，所得的结果也不能直接说明所研究的除草剂对该生物的风险。而采用假设法(hypothesis approaches)开展的试验，虽然可以直接得出该除草剂的风险，但不能获得生殖或遗传毒性的阈值。今后的生殖和遗传毒性研究设计可以考虑将急性毒性资料与环境资料相结合，试验动物既是毒理学研究中的模式生物，也是生态系统中的非靶标生物，所得的结果将具有一定的生态毒理学意义。而与生态系统中的动物相比，人类的暴露途径更为多样，在除草剂的生产及使用过程中有发生职业暴露的可能，暴露的危害可能更大，而针对人的研究时效性较差。研究者可对稻田、麦田或林场等不同除草剂应用场景中的非靶标生物予以更多关注，以这些动物为模式生物开展生殖或遗传毒性研究，其结果对于人类的生殖遗传健康有一定的参考价值。