司徒荣贵 黄 婷 彭冠明 林昌明 黄炬峰 毛积鹏,2

（1. 台山市红岭种子园，广东 台山529223；2. 华南农业大学 林学与风景园林学院/广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642）

松花粉，又名松花、松黄，泛指马尾松Pinus massoniana、油松P. tabuliformis、红松P. koraiensis和樟子松P. sylvestris等国内松属植物雄蕊所产生的干燥花粉[1]。是一味历史悠久的药食同用中药，始载于东汉《神农本草经》，富含氨基酸、脂质、维生素、核酸、萜类和黄酮等多种营养成分和生物活性物质[2-4]。具有“天然微型营养库”、“完全营养品”和“绿色宝库中的黄金粉”等美誉[5-6]。现代药理研究表明，松花粉具有调节免疫[7-8]、抗氧化[9]、抗炎[2]、抗疲劳[10]、抗重金属毒性[11-12]、降血糖、降血脂、防止心脑血管病[13]、保护内脏[14]、和抗肿瘤[15]等多种生物学活性和保健功能。例如，鲍善芬等[16]研究发现松花粉对生化反应系统所产生的过氧化氢、超氧自由基、羟自由基和次氯酸等活性氧系具有较好的清除作用。刘协等[10]人研究表明松花粉能有效对抗酒精中毒引起的肝脏脂质过氧化损伤，能有效的保护肝脏。钱进[13]研究发现破壁松花粉还具有降低血糖的作用。虽然针对松花粉活性成分和药理作用的研究已开展了许多深入的研究，但基本以本土松属树种为研究对象。对引进的国外松如火炬松P. taeda和湿地松P. elliottii及杂交松湿加松P. elliottii×P.caribaea花粉的研究鲜有开展[17-18]。本研究基于代谢组学技术手段对马尾松、火炬松、湿地松和湿加松4 种松花粉进行了成分鉴定和差异比较分析。旨在为更好的开发和利用松花粉提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

分别以种植于广东省台山市红岭种子园的湿地松和湿加松，信宜市林业科学研究所的马尾松和英德市林业科学研究所的火炬松为研究材料。分别随机收集了4 个树种18 个单株的花粉。每3 个单株的花粉混合为一份样品，共6 个生物学重复。

1.2 样品提取

各样品分别精确称取200 mg（±1%）于10 mL EP 管中。随后加入5 mL 甲醇溶液，充分混匀后室温超声60 min，4℃条件下，12 000 rpm离心12 min。取上清液浓缩至干后加200 μL 甲醇复溶，混匀后取上清液过0.22 μm 微孔滤膜。滤液保存于进样瓶中用于超高效液相色谱—质谱联用（UPLS-MS/MS）分析。

1.3 色谱和质谱数据采集

色谱条件：仪器采用Thermo Vanquish，使用ACQUITY UPLC® HSS T3 1.8 µm（2.1 mm×150 mm）色谱柱。自动进样器温度设为8 ℃，以0.25 mL/min 的流速，40 ℃的柱温，进样 2 μL 进行梯度洗脱。流动相为正离子0.1%甲酸水（B1）-0.1%甲酸乙腈（A1）；负离子 5 mM 甲酸铵水（B3）- 乙腈（A3）。梯度洗脱程序为0～1 min，2% A1/A3；1～9 min， 2%～50% A1/A3；9～12 min，50%～98% A1/A3；12～13.5 min，98% A1/A3；13.5～14 min，98%～2% A1/A3；14～20 min，2% A1-正模式（14～17 min，2% A3 -负模式）。

质谱条件：仪器使用 Thermo Q Exactive Plus，电喷雾离子源（ESI）。正负离子电离模式，正离子喷雾电压为 3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV。鞘气 30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率70 000 进行全扫描，扫描范围81～1 000，并采用HCD 进行二级裂解。碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的 MS/MS 信息。

1.4 代谢物定性与定量分析

基于自建库和公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性分析，分析时去除同位素信号、含K+离子、Na+离子和NH4+离的子重复信号。代谢物定量则是利用三重四级杆质谱的多反应检测模式进行。差异代谢物的筛选则以单变量分析的差异倍数（Fold change）值大于2 或小于0.5 及多元统计分析中的正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal Partial Least Squares—Discriminant Analysis，OPLS-DA） 模型的VIP（Variable Importance in Projection）值大于1 为筛选指标。

1.5 数据分析

通过Proteowizard 软件（V.3.0.8789）将获得的原始数据转换成mzXML 格式，随后利用R（V.3.3.2）的XCMS 程序包进行峰识别、峰过滤和峰对齐分析。使用Microsoft Excel （16.0）软件对质核比、保留时间和峰面积进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 质量控制与保证

在进行基于质谱技术的代谢组学研究时，为了获得可靠且高质量的数据，通常需要进行质量控制（Quality Control, QC）。各QC 样本的主成分分析（Principle Component Analysis, PCA）结果如图1 左所示。结果显示QC 样本密集分布、重复性好、差异小，说明检测系统稳定。为了发现生物标记物，潜在的特征峰在QC 样本中的相对标准偏差（Relative standard deviation, RSD）不能超过30%。因此，在QC 的基础上通常会进行质量保证（Quality Assurance, QA），QA 结果如图1 右所示。结果表明RSD 小于30%的特征峰比例达到70%以上，说明数据良好。

图1 QC 样本的主成分分析和相对标准偏差分析Fig.1 The principle component and relative standard deviation analyses of QC samples

2.2 代谢物全鉴定

利用UPLC-MS/MS 在马尾松、火炬松、湿地松和湿加松4 种松花粉组织中共鉴定到368 种代谢物成分。其中有机酸类74 种、脂质类物质71 种、氨基酸及其衍生物66 种、糖及醇类物质31 种、萜类化合物26 种、黄酮类化合物22 种、核苷酸及其衍生物类21 种、生物碱类14 种、维生素10 种、酚酸类5 种木质素和香豆素类5 种、其它类化合物成分23 种。部分代谢物成分如表1 所示。

表 1 部分代谢物信息Table 1 The information of part metabolites

2.3 差异代谢物统计分析

在4 种松花粉组织的6 个比对组中共鉴定到175 种差异积累代谢物。其中脂质34 种、有机酸34 种、氨基酸及其衍生物31 种、糖及醇类15种、核苷酸及其衍生物15 种、萜类化合物13 种、黄酮类11 种、生物碱类5 种、维生素4 种、木脂素和香豆素2 种、酚酸类1 种、其它类10 种。KEGG 富集分析结果发现，鉴定到的差异代谢物主要富集于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，黄酮和黄酮醇代谢通路、谷胱甘肽代谢通路及单萜生物合成通路（图2）。

图2 差异代谢KEGG 富集分析Fig. 2 The KEGG enrichment analysis of differential metabolites

显著性差异分析结果发现，共45 种代谢物在不同松树的花粉组织中含量差异特异性显著。野黑樱苷、松脂醇、新松香酸、异槲皮苷、香芹酮、前列腺素B2、前列腺素D2、前列腺素H2、前列腺素J2、赤霉素A53 和赤霉素A4 等31 种代谢物在马尾松花粉组织中显著高积累。其中原儿茶酸和神经酸在马尾松花粉组织中特异性积累（图3）。谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺和烟酰胺等7 种代谢物在火炬松花粉组织中显著高积累。吲哚乙酰胺和茉莉酮酸甲酯2 种代谢物在湿地松花粉组织中显著高积累。纤维二糖、海藻糖和维生素B6 等5 种代谢物则在湿加松花粉组织中显著高积累（表2）。

图3 原儿茶酸和神经酸的显著性差异分析Fig.3 The significant differences analysis of protocatechuic acid and nervonic acid

3 讨论与讨论

本研究利用UPLC-MS/MS 代谢组学技术对2种国外松火炬松和湿地松、1 种杂交松湿加松和1种本土松马尾松的花粉组织的代谢物成分进行了鉴定及差异分析。共鉴定出代谢物368 种，主要为脂质、有机酸、氨基酸和黄酮等化合物。其中8 种人体必需氨基酸，包括亚油酸和亚麻酸在内的多种不饱和脂肪酸；维生素B1、B2、B3、B5、B6 和烟酰胺；儿茶素、槲皮苷和异槲皮苷等黄酮化合物；前列腺素A2、B2、C2、D2、E1、F1、F2、G2、H2、I2、J2 和海藻糖等高生物活性物质均被成功鉴定。表明UPLC—MS/MS 及其相关代谢组学技术适用于药用植物高生物活性物质的鉴定及挖掘。先前已有相关学者利用UHPLC-MS/MS、LS-MS/MS 或UHPLC -QTOF/MSE 代谢组学技术分别对黄岑Scutellaria baicalensis[19]、新疆一支蒿Artemisia rupestris[20]和文冠果Xanthoceras sorbifolia[21]等药用植物的不同采收时期或不同组织部位进行了代谢组学分析。差异统计分析结果表明，共有175 种代谢物在4 种不同松树的花粉组织中含量有差异。其中44 种代谢物在不同松花粉组织中的含量差异特异性显著，主要显著高积累于马尾松松花粉组织中。初步表明，马尾松松花粉的营养物质及活性成分含量略高于湿地松、火炬松和湿加松的松花粉。但包括8 种人体必需氨基酸在内的绝大部分鉴定到的氨基酸及其衍生物在4 种花粉组织中的含量均无显著差异。绝大部分的不饱和脂肪酸和黄酮类化合物在4 种花粉组织中的含量也无显著差异。综合表明，国外松火炬松、湿地松和湿加松及本土松树马尾松的松花粉组织均富含多种营养成分和高生物活性物质，可为相应的药物和保健产品提供原材料。本研究结果为更好的开发和利用多种松花粉提供了一定的物质基础。