李文俊 李强 韩崇 李陇旭 易祖盛 桂林 钟良明

摘要 [目的]全面了解光倒刺鲃的遺传多样性和遗传结构，为其种质资源保护和利用提供科学依据。[方法]采用自行设计的引物对9条水系共209尾光倒刺鲃样本的线粒体COI基因序列进行测定与分析，并探讨其遗传结构和遗传多样性水平。[结果]在209条COI基因序列中，共检测到12个单倍型，单倍型多样性为0.80 核苷酸多样性为0.008 2。单倍型系统树显示，所有群体聚成2支，东江群体的全部样本及北江、赣江和九龙江水系的部分样本组成Ⅰ支，其余样本组成Ⅱ支。单倍型网络分析显示，东江群体单倍型与北江、赣江和九龙江部分个体关系较近，但与其他个体关系相对较远;珠江水系大部分群体与长江、钱塘江、九龙江大部分群体分布于不同的分支。AMOVA分析表明，光倒刺鲃COI基因序列变异主要来自地理区内群体间，占82.33%。错配分析及中性检验显示，大多数群体相对稳定，未发生过群体扩张。[结论]光倒刺鲃群体的遗传多样性总体偏低，应加强对其种质资源的保护;东江水系与珠江水系其他群体既存在一定隔离，又存在着基因交流;珠江水系群体与长江水系群体间分化明显。

关键词 光倒刺鲃;COI基因;遗传多样性;遗传分化

中图分类号 S-917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）22-0125-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Genetic Diversity and Genetic Differentiation of Spinibarbus hollandi Based on COI gene

LI Wen-jun， LI Qiang， HAN Chong et al

（School of Life Science， Guangzhou University， Guangzhou，Guangdong 510006）

Abstract [Objective] To understand the genetic diversity and genetic structure of Spinibarbus hollandi more comprehensively， and provide scientific basis for the conservation and utilization of its wild germplasm resources.[Method] The mitochondrial COI gene sequences of 209 S. hollandi samples from 9 rivers were determined and analyzed with designed primers， and its genetic diversity and genetic differentiation level were discussed. [Result] Among 209 COI gene sequences， 12 haplotypes were detected， with haplotype diversity of 0.801 0 and nucleotide diversity of 0.008 2. Phylogenetic tree of haplotypes showed that all haplotypes gathered into two branches （branches 1： all the samples Dongjiang population and some individuals of Beijiang， Ganjiang and Jiulong River）. Network analysis of haplotypes showed that haplotype of Dongjiang population was closely related to some individuals in Beijiang， Ganjiang and Jiulong River， but far related to other individuals. The majority of the population of the Pearl River distributed in different branches compared with the majority of the population of the Yangtze River， Qiantang River， and Jiulong River. AMOVA analysis showed that the variation of COI gene sequences of S. hollandi was mainly from within groups， accounting for 82.33%. Mismatch analysis and neutral test showed that most populations were relatively stable without population expansion. [Conclusion] The genetic diversity of S. hollandi population is generally low， so the protection of its germplasm resources should be strengthened. There is not only certain isolation but also gene exchange between Dongjiang population and other populations in the Pearl River. There is obvious differentiation of populations between the Pearl River and the Yangtze River.

Key words Spinibarbus hollandi;Cytochrome oxidase subunit I sequence;Genetic diversity;Genetic differentiation

鱼类线粒体DNA已成为研究鱼类进化遗传与系统演化关系的重要分子标记，广泛应用于群体遗传学研究[1]。而细胞色素氧化酶亚基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）为线粒体13个蛋白编码基因中研究最为清楚的基因之一，其进化速率较低，包含的遗传进化信息量大，已被广泛应用于种群分析、系统发育和种类鉴别等研究领域[2-3]。光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）隶属鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鲃亚科（Barbinae）倒刺鲃属（Spinibarbus），分布于华东及华南诸水系[4-5]，是一种重要的名优经济鱼类。随着光倒刺鲃的人工驯养及繁育技术获得成功及多年的推广养殖，现已成为华南及华东等地重要的养殖鱼类之一。近年来，由于过度捕捞、环境污染及水利工程建设等原因，光倒刺鲃自然资源量不断减少。然而，目前有关光倒刺鲃群体遗传多样性、遗传结构及亲缘地理等方面的研究较少[6-8]。该研究采集了9个群体的光倒刺鲃样本，对其线粒体COI基因序列进行了测定与分析，旨在全面了解其遗传多样性和遗传结构，为其种质资源保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

所用样品于2019年5—12月采自广西、广东、湖南、江西、福建和浙江等地。将所有个体按所采样的水系进行群体划分。各采样点和样品信息见图1和表1。

1.2 DNA提取及測序

基因组DNA使用DNA抽提试剂盒（生工生物工程股份有限公司，上海）提取。PCR扩增采用自行设计的引物进行，其序列分别为L：5′- GGGCTGATAGGAAGAGGACTT -3′;H：5′- GATGAGTTGGACAGGACGATT -3′。PCR反应体系（25 μL）：PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol/L引物各1.0 μL、模板DNA 3.0 μL及ddH2O 7.5 μL混合。扩增程序：①94 ℃预变性3 min;②94 ℃变性30 s，③55 ℃退火30 s;④72 ℃延伸90 s，重复35次;72 ℃延伸10 min。PCR产物由生工生物工程股份有限公司纯化并测序。

1.3 数据分析

通过DNASTAR程序对序列进行拼接，使用Muscle软件进行比对分析。利用MEGA 6.0软件计算群体遗传距离，基于邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建单倍型系统树[9]。使用软件DNAsp 5.0[10]和Arlequin 3.5[11]统

计各群体的核苷酸多样性（nucleotide diversity，π）与单倍型多样性（haplotype diversity，h），进行错配分布（mismatch distribution）分析、中性检验以及分子变异分析（AMOVA）。使用Network 10.0软件构建各单倍型之间的网络关系图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

在209个COI序列中，共检测到12个单倍型。有4个为多群体共享的单倍型，其余为单个群体特有单倍型。单倍型多样性为0.80 核苷酸多样性为0.008 2（表2）。其中，北江、赣江及资江群体的单倍型多样性高于其他群体，均大于0.500，其他群体的单倍型多样性较低。此外，北江、赣江及九龙江群体的核苷酸多样性较其他群体高，π值均大于0.004 0，而其他群体的核苷酸多样性较低，π值均在0.001 0以下。

2.2 遗传距离及遗传分化水平

遗传距离分析可知（表3），东江群体与其他群体的遗传距离均相对较高。除北江群体外，东江与其他群体间遗传距离均大于0.015 0，北江与其他群体间遗传距离次之。遗传分化分析显示，北江群体与其他群体间遗传分化指数均较低，小于0.500 0;除北江群体外，东江群体与其他群体的遗传分化指数均较高;钱塘江群体与北江、赣江及九龙江的遗传分化指数较低，与其他群体的遗传分化指数均较高。

2.3 亲缘关系

对12个单倍型进行系统发育分析，构建系统发育树（图2）和单倍型网络图（图3）。从图2可见，所有光倒刺鲃群体聚成2个支系。其中东江群体与部分北江、赣江和九龙江群体的个体组成了支系Ⅰ。而在支系Ⅱ中，又可分为A和B 2个姐妹支系。A支为珠江水系的样本，包含柳江、郁江的全部样本及北江的部分样本;B群则包含资江、钱塘江的全部样本及赣江和九龙江的大部分样本。单倍型网络图（图3）也可分为3个分支。其中长江水系的资江和赣江群体、钱塘江群体及九龙江的部分单倍型共同聚为分支 而珠江水系（柳江、桂江及郁江群体的所有单倍型及北江群体的部分单倍型）单独聚为分支3。东江群体与部分北江和赣江个体共享的单倍型H1与九龙江的单倍型H12聚为分支 两者亲缘关系较近，遗传变异仅3步，但与其他分支单倍型的变异达到16步以上。以上表明东江群体与其他群体相比，存在较明显的遗传分化，但同时又与部分北江、赣江和九龙江的部分个体存在较近的亲缘关系;另外，珠江水系与长江、九龙江和钱塘江水系之间也存在较明显的分化。

2.4 分子变异分析

为了解光倒刺鲃种群分子变异的分布模式，根据水域分布将光倒刺鲃群体分成珠江、长江、九龙江和钱塘江4个地理区，进行分子变异分析。分析表明，光倒刺鲃地理区之间变异占-20.72%，地理区内群体间占82.33%，群体内的变异占38.39%。这说明光倒刺鲃COI基因的遗传分化主要来自地理区内的群体之间。

2.5 种群动态分析

对各群体进行中性检验分析发现，在Tajimas D检验中，郁江和柳江的Tajimas D值均为负值且统计检验均显著（P<0.05），其余群体为正值或为负值，但统计检验不显著;而在Fus Fs检验统计中，除郁江群体的Fus Fs值为显著的负值（P<0.05）外，其余群体为正值或负值，但统计检验不显著，说明郁江群体可能发生过扩张。在错配分析中，郁江群体的歧点分布图呈现单峰型，进一步说明郁江群体经历过扩张。因此，综上可知郁江群体可能发生过扩张，而全部群体和其他各个群体相对稳定，未发生过扩张。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 光倒刺鲃的遗传多样性。

遗传多样性是物种适应性和进化的基础，种内的遗传多样性与该物种对环境的适应能力呈正向线性关系[12]。核苷酸多样性和单倍型多样性是衡量一个群体mtDNA变异程度的重要指标[13]。该研究基于COI序列的光倒刺鲃核苷酸多样性π值为0.008  整体遗传多样性较低，与同区域或邻近区域的黄尾鲴（Xenocypris davidi）[14]和银鲴（Xenocypris argentea）[15]等鱼类相仿。所有群体比较而言，北江、赣江和九龙江群体的核苷酸多样性相对较高，而东江、桂江、郁江、资江和钱塘江群体的核苷酸多样性均较低。造成光倒刺鲃群体遗传多样性较低的原因可能有：①光倒刺鲃为产区重要的经济鱼类，但部分水域不合理捕捞行为尚未得到遏制，可能使光倒刺鲃的群体数量大幅下降，影响了其遗传多样性;②随着各个流域中建设大量水利工程，造成鱼类栖息地严重萎缩和破碎化分布，阻隔了各水系间基因交流，也可能导致光倒刺鲃群体遗传多样性进一步降低。除此之外，河流水质污染也是影响鱼类多样性的重要因素。光倒刺鲃为产区重要的经济鱼类具有较大的经济价值，为了持续利用其种质资源，应积极保护其种内遗传多样性。目前，我国已经建立了多个光倒刺鲃国家级种质资源保护区[16]，这有助于光倒刺鲃种质资源的保护。

3.1.2 群体间的遗传分化。

光倒刺鲃的遗传分化水平分析显示，东江与其他群体间遗传分化指数较高。系统发育分析显示，东江水系样本与北江、赣江和九龙江水系的部分样本组成了独立的分支Ⅰ。东江除了与北江、赣江以及九龙江部分个体关系较近外，与其他群体亲缘关系较远，单倍型间的变异达到16步以上。结果表明，东江群体与其他群体之间存在较明显的遗传分化，同时与北江、赣江和九龙江部分个体间的遗传关系也较近。Yang 等[17]在对银鮈（Squalidus argentatus）的研究发现，东江、韩江与九龙江群体为一个单系群，与华南地区其他群体不同，这与该研究的结果相似。从地理分布上看，东江被狮子洋与北江和西江隔离。在间冰期时由于海平面上升，东江与北江隔离，光倒刺鲃作为溪流鱼类难以进行基因交流，使得东江群体与北江、西江群体发生了分化，而这3条河流在冰期海平面大幅下降时又发生了汇聚[18-19]，使得东江与北江的群体得以交流。另一方面，东江水系群体与赣江水系和九龙江群体的部分个体关系较近。这可能由于东江水系与赣江水系紧邻，水系间的袭夺及连接事件使得2个水系部分个体存在较近的亲缘关系;九龙江水系群体部分个体可能由东江群体扩散而来，而随着华南大陆东部莲花山脉的隆起，进而阻隔了两者间的遗传交流。东江群体与其流域两侧水系的群体既存在一定程度的隔离，又存在着基因交流。这种较为独特的鱼类遗传分化格局，可从其鱼类组成特征得到印证。东江水系既有其特有的鱼类，如三线拟鲿（Pseudobagrus trilineatus）、白线纹胸鮡（Glyptothorax pallozonum）等[20-21]，又有珠江水系特有鱼类，如沙花鳅（Cobitis arenae）[22]、北江光唇鱼[23]等，还有与韩江及九龙江等水系共同特有的鱼类，如裸腹原缨口鳅（Vanmanenia gymnetrus）[21]、带刺光唇鱼（Acrossocheilus spinifer）[24]等。

该研究的系统树与单倍型网络图分析表明，光倒刺鲃的珠江與长江水系的群体分别位于不同分支，说明它们之间存在一定的遗传分化。笔者对光倒刺鲃形态研究发现，珠江水系群体与长江、钱塘江等水系的群体在体色、体型等性状上存在着一定差异，珠江群体的特点为体青绿色，腹鳍及臀鳍金黄色，体型较高等;长江、钱塘江等的特点为体青灰色，腹鳍及臀鳍红色，体型较长等。造成这些差异的原因可能是南岭的隆起[25]，限制了其南北两侧水系群体的基因交流，经过长期的性状差异积累，使得南岭两侧的群体产生了一定程度的遗传分化。因而，复杂的地形地貌可能导致光倒刺鲃形成了较明显的地理差异，对应群体应分别作为独立管理单元进行保护利用。

3.2 结论

该研究对9个群体光倒刺鲃的209条COI 基因研究表明，光倒刺鲃群体的遗传多样性总体偏低，应加强对其种质资源的保护;东江水系与其他群体既存在一定隔离，又存在着基因交流，同时珠江水系群体与长江水系等群体间具有分化明显，地形地貌的衍化对光倒刺鲃种群分化产生一定影响。

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