范金波，邢 莉，李孟雨，麻 奥，吕长鑫，励建荣

（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

蜂胶是一类独特的黏合剂和树脂物质，具有多种生物学活性[1]。黄酮类与酚酸类化合物在其中大量存在，使其具备丰富的营养价值，然而目前只对少部分蜂胶活性成分进行过研究[2]。咖啡酸β-苯乙醇酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）在蜂胶生物活性成分中占重要地位，具有免疫调节、抗癌、抗微生物、抗炎和抗氧化等一系列的生物活性，尤其在抗癌方面表现出很大的潜力[3-7]。目前已有研究者利用化学方法合成了CAPE，解决了从蜂胶中提取时提取率低的问题[8]。CAPE属于酚类衍生物，稳定性差，生物利用度低，常使用蛋白质作为载体实现保护作用[9-11]。

人血清蛋白（human serum albumin，HSA）是人血浆中浓度最高的载体蛋白，能和各种内源性与外源性的分子进行结合并递送，例如脂肪酸、营养素、类固醇以及许多常用药物如华法林和布洛芬等[12]，成为了当前研究最为普遍的蛋白之一。HSA是单肽链的蛋白，由585 个氨基酸残基组合而成，17 个二硫键有助于维持其心形形状。HSA由3 个同源结构域构成（I、II、III），各结构域又可细分为A和B两个亚结构域，芳香族和杂环配体分子分别结合到亚结构域IIA（site I）和IIIA（site II）的疏水腔，具有特定的生理活性[13-14]。位于亚结构域IIA（Trp 214）的色氨酸残基，其荧光强度对小分子配体敏感，因此常被用作探针，监测该位点上配体与HSA的结合情况[15]。Li Hongliang等[16]采用多光谱和分子对接技术研究了CAPE与HSA的特异性结合作用，并与前人研究的蜂胶组分对比发现pH 7.4条件下，CAPE对HSA具有较强的内源性荧光猝灭作用，CAPE与HSA结合能力显著强于其他蜂胶活性成分。

目前，CAPE参与人体循环系统药代动力学过程的详细转运机制尚不清楚，CAPE与HSA生理条件下结合作用已有报道，但不同pH值对CAPE与HSA结合作用的影响鲜有报道。本实验拟通过荧光发射光谱探究pH值对CAPE与HSA结合行为的影响，通过同步荧光光谱分析CAPE结合对蛋白结构的影响，通过位点Marker实验确定两者的结合位点，实验结果为CAPE活性稳态化保持、靶向递送提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HSA（99%） 北京百灵威科技有限公司；CAPE（98%）、华法林（98%）、布洛芬（98%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；柠檬酸、无水乙醇、磷酸氢二钠等均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光分光光度计 日本日立高新技术公司；FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q Reference型超纯水机 德国默克密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 储备液的配制

配制0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 3.0、5.0和7.4），并配制1.2×10-4mol/L的HSA储备液，以及浓度为7.2×10-4mol/L CAPE、华法林、布洛芬储备液。

1.3.2 CAPE与HSA相互作用的荧光光谱测定

荧光发射光谱：取7 支离心管，先加入不同pH值的缓冲溶液，再加入1.2×10-4mol/L HSA 30 μL，最后加入一定体积7.2×10-4mol/L CAPE，得到3 mL的混合溶液，使之充分反应20 min。最终HSA浓度为1.2 μmol/L，CAPE浓度为0～14.4 μmol/L。分别在298 K和310 K温度下，设置激发和发射光栅分别为2.5 nm和5 nm，激发波长为280 nm，以700 nm/min的扫描速率，对290～450 nm的发射光谱进行荧光发射光谱的测定。

同步荧光光谱：在298 K和310 K温度下，λEx和λEm的波长间隔分别设为Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，激发光栅为2.5 nm和发射光栅为5 nm条件下，对波长250～350 nm的同步光谱进行测量。

1.3.3 CAPE与HSA的结合位点分析

参照1.3.2节方法，在加入CAPE前，先加入华法林/布洛芬充分摇匀反应20 min，使其浓度为6.0 μmol/L，后续操作与1.3.2节相同。并设置对照组。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 CAPE对HSA荧光强度的影响

如图1所示，在298 K时，3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生荧光猝灭现象，随着CAPE浓度的增加（0～14.4 μmol/L）荧光强度呈规律性的减弱，峰形无显著变化。在pH 3.0时，HSA的荧光强度峰值降低了43%；pH 5.0时，HSA的荧光强度峰值降低了40%；pH 7.4时，HSA的荧光强度峰值降低了78%。不同pH值条件下，最大发射波长（λmax）出现不同的变化趋势，pH 3.0时发生微弱蓝移（327～326 nm），pH 5.0时发生微弱红移（338～339 nm），pH 7.4时发生红移（339～343 nm），可能是由于pH值和CAPE对HSA共同作用使荧光发色团附近的微环境发生了变化，红移使极性增强。由图1D所示，猝灭率随着CAPE浓度的增大而增大，其中pH 7.4时的猝灭率明显高于pH 3.0和pH 5.0，差异显著（P＜0.05）；而pH 3.0和pH 5.0相比，差异不显著（P＞0.05）。

图1 298 K条件下pH值对CAPE与HSA结合荧光光谱的影响Fig.1 Effect of pH on fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 298 K

如图2所示，310 K时，在3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生荧光猝灭现象，且峰形未发生明显变化。当pH 3.0、5.0和7.4时，HSA的荧光强度峰值分别降低了43%、62%和81%。pH值变化影响了λmax，pH 3.0、5.0和7.4时，随着CAPE浓度的增加λmax分别红移6 nm（325～331 nm）、红移8 nm（336～344 nm）和红移3 nm（337～340 nm）。这表示CAPE与HSA发生了相互作用，加之pH值的影响改变HSA的结构，使荧光基团附近的微环境产生变化，极性增强。由图2D可知，相同CAPE浓度下，猝灭率随着pH值的升高而增大，pH 7.4时最高，pH 3.0时最低，说明pH值影响了CAPE与HSA的结合作用。

图2 310 K条件下pH值对CAPE与HSA结合荧光光谱的影响Fig.2 Effect of pH on fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 310 K

2.2 荧光猝灭机理和结合常数

HSA与小分子之间的荧光猝灭类型主要分为静态和动态[17]。静态猝灭的过程是猝灭分子和HSA在基态形成了不发光的物质；动态猝灭是HSA的激发态分子和猝灭分子发生了碰撞，返回到基态，2 种方式均可以使HSA的荧光强度降低。静态猝灭的猝灭常数Ksv和温度呈反比，动态猝灭呈正比。本实验采用Stern-Volmer方程（1）和Acharya方程（2）分析荧光猝灭机理[18]。

式中：F0和F分别为未加和加入CAPE时荧光强度；[Q]为CAPE的浓度/（mol/L）；Kq为双分子猝灭速率常数；τ0为荧光团的平均寿命，为10-8s；Ksv为猝灭常数；Ka为结合常数。

R2值越接近于1，证明数据越精确。根据方程（1），可计算不同条件下CAPE与HSA结合的猝灭常数Ksv。由表1可知，在pH 3.0、5.0、7.4条件下，Ksv均随温度上升而增大，但由于Kq均远大于2×1010L/（mol·s）（生物分子的最大散射碰撞猝灭常数），说明CAPE对HSA的猝灭类型是静态猝灭[19-20]。相同温度条件下（310 K）pH值变化影响了Ksv，且随着pH值的升高而出现增加趋势，pH 7.4时Ksv出现最大值，验证了图2的结果。结合常数Ka在不同条件下都为104～106数量级，证明二者的结合能力较强。pH值变化显著影响了结合常数，在生理条件（pH 7.4）下最大。

表1 CAPE与HSA相互作用常数Table 1 Interaction constants of CAPE with HSA

2.3 热力学性质和作用力类型

小分子和HSA之间主要基于氢键、范德华力、疏水相互作用和静电相互作用4 种作用力结合[21]。在298 K和310 K温度下通过Van’t Hoff方程（3）和热力学方程（4）计算热力学参数[22]：

式中：K1、K2对应T1（298 K）、T2（310 K）时的结合常数；ΔH为焓变/（kJ/mol）；ΔG为结合反应的吉布斯自由能变化/（kJ/mol）；ΔS为熵变/（J/（mol•K））；R为气体常数（8.314 J/（mol•K））；温差较小时，ΔH可作为常数[23]。

从理论上讲，当ΔH＜0或ΔH≈0和ΔS＞0时，静电相互作用扮演交互的主要力量；当ΔH＞0，ΔS＜0时，主要基于静电和疏水相互作用结合；ΔH＜0，ΔS＜0时，氢键与范德华力作为交互的主要力量；ΔH＞0，ΔS＞0时，疏水作用起主要作用[24-25]。由表2可知，ΔH＜0，ΔG增加（ΔG＜0），ΔS＜0，说明CAPE与HSA之间的结合是熵减少，吉布斯自由能升高，自发进行的放热过程，二者间的作用力表现为氢键和范德华力。

表2 CAPE与HSA相互作用的热力学常数Table 2 Thermodynamic constants of interaction between CAPE and HSA

2.4 同步荧光光谱测定

在298 K和310 K温度下测定不同配体浓度的HSA同步荧光光谱。当λEx和λEm的波长间隔设定在15 nm时反映酪氨酸残基的光谱信息；设定在60 nm反映色氨酸残基的光谱信息[26-27]。酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波长（λmax）均与附近微环境的极性相关，若λmax蓝移，则周围环境的疏水性增强；反之极性增强[28]。所以能够依据λmax的改变，判断CAPE的参与对蛋白质构象的改变[29]。

如图3所示，298 K温度下，无论Δλ=15 nm还是Δλ=60 nm，CAPE的参与对HSA都存在猝灭作用，而且随CAPE浓度逐步升高，HSA荧光强度逐渐降低。当Δλ=15 nm时，pH 3.0与pH 7.4条件下，对应的酪氨酸残基的吸收峰微弱蓝移1 nm和2 nm，pH 5.0时未发生位移；当Δλ=60 nm时，pH 5.0和pH 7.4条件下，色氨酸残基的吸收峰蓝移1 nm和6 nm，pH 5.0时未发生位移。且伴随pH值的增大，色氨酸最大吸收峰的降低趋势更加明显。表明CAPE的加入，加之pH值的影响，使色氨酸附近微环境的疏水性增强，极性减弱[30]。

图3 298 K及pH 3.0（A）、pH 5.0（B）、pH 7.4（C）时CAPE对HSA的同步荧光光谱的影响Fig.3 Effects of different pHs on synchronous fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 298 K

如图4所示，310 K温度下，伴随CAPE浓度的升高，酪氨酸与色氨酸残基内源荧光强度均呈现规律性地降低，与图3呈现出相似的规律。当Δλ为15 nm时，pH 5.0和pH 7.4条件下，对应酪氨酸残基的吸收峰微弱蓝移1 nm和2 nm，pH 3.0时未发生位移；当Δλ为60 nm时，pH 3.0和pH 7.4条件下，色氨酸残基的吸收峰蓝移1 nm和3 nm，pH 5.0时红移1 nm。由此能够推测，2 种氨基酸残基附近的微环境均产生了微弱的变化。且色氨酸最大吸收峰的降低趋势随pH值的增大更为明显，pH 7.4时最明显。综上所述，HSA中的酪氨酸残基与色氨酸残基比较，后者的荧光强度减弱的更显著。说明色氨酸残基可能比酪氨酸残基更接近于结合位点，CAPE的加入和pH值的共同影响改变了HSA的构象。

图4 310 K及pH 3.0（A）、pH 5.0（B）、pH 7.4（C）时CAPE对HSA的同步荧光光谱的影响Fig.4 Effects of different pHs on synchronous fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 310 K

2.5 CAPE与HSA结合位点的分析

华法林和布洛芬均能够特异性地与HSA结合，结合位点分别位于HSA的亚结构域IIA（Sudlow’s site I）和亚结构域III A（Sudlow’s site II）。本实验选择布洛芬和华法林作为位点Marker，通过比较位点Marker存在时猝灭率的变化判断CAPE与HSA的结合位点[31]。

由图5可以得出，二者的存在均显著降低了CAPE与HSA的结合，华法林存在时产生的荧光猝灭变化比布洛芬更显著。结果说明CAPE与HSA的结合位点位于亚结构域IIA和IIIA之间，更接近于Sudlow’s site I。

图5 298 K、pH 7.4布洛芬和华法林对CAPE与HSA结合的影响Fig.5 Effects of IBUP and WARF on binding between CAPE and HSA at 298 K and pH 7.4

3 结 论

本实验采用荧光光谱法研究CAPE与HSA在pH 3.0、5.0、7.4条件下的结合作用，经过分析计算出猝灭常数、猝灭类型、结合常数、作用力类型，再通过同步荧光探究3 种pH值条件下CAPE对HSA构象的影响，最后位点Marker实验确定结合位点。结果表明3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生了荧光猝灭现象，类型为静态猝灭，pH 7.4时具有最强的猝灭作用，同时结合常数最大，说明生理条件下CAPE与HSA更容易结合；热力学参数表明CAPE与HSA主要通过范德华力和氢键作用结合；同步荧光表明CAPE和pH值的共同影响改变了HSA的构象；位点Marker实验表明，CAPE与HSA的结合位点位于Sudlow’s site I附近。实验结果证明，pH值的增加促进了CAPE与HSA的结合，这对于探究蜂胶生物活性成分在体内的转运，以及为蛋白基-CAPE载体的开发提供了理论依据。