于 典，黄 磊△，华国栋，何 婷，巩 颖，杨 维

（1.北京中医药大学东方医院药学部，北京 100078； 2.北京中医药大学东直门医院药学部，北京 100700）

对中药功效的深入研究发现，单一的活性成分或指标性成分均难以反映中药的真伪和质量［1］。通用现代的分析技术分析中药和中药复方，能为鉴别中药材的真伪和质量提供有效参考［2］，其中建立指纹图谱是评价药品质量的关键环节和基础［3］。指纹图谱的参照物质多选择药材中易获取的主要活性成分或指标性成分，以考察药材图谱稳定性及辅助辨别图谱重复性。若临床药效未能取得确切关联，则指纹图谱的参照物将起到辨别和评价药材图谱特征的引导作用［4］。萘醌类、苯醌类、黄酮类、生物碱类及多糖类物质是药用紫草的主要活性成分，其中萘醌类化合物的抗癌作用和较强的脂溶性特征是当前紫草研究的热点，左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β－β′二甲基丙烯酰紫草素、β－羟基异戊酰紫草素、去氢阿卡宁和β－羟基异戊酰阿卡宁等物质也均是紫草的主要物质成分［5］。本研究中选取左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素为参照物，建立了紫草药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BSA124S型分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，精度为0.0001 g）。

1.2 试药

左旋紫草素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110769－200506，含量≥95%）；乙酰紫草素对照品（上海士锋生物技术有限公司，批号为15062715，含量≥98%）；去氧紫草素对照品（北京迈瑞达科技有限公司，批号为19072541，含量≥98%）；β－β′－二甲基丙烯酰紫草素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为Y02A9H67135，含量≥98%）；紫草（批号分别为ZC－2020001和ZC2020002的来自新疆哈密，批号分别为ZC－2020003和ZC－2020004的来自新疆阿勒泰，批号分别为ZC－2020005和ZC－2020006的来自新疆喀什，批号分别为ZC－2020007和ZC－2020008的来自新疆乌鲁木齐，批号分别为ZC－2020009和ZC－2020010的来自尼泊尔）；甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu VP－ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈－0.3%磷酸水溶液（梯度洗脱，洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL／min；检测波长：274 nm；柱温：25℃；进样量：10μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制备

称取左旋紫草素对照品、乙酰紫草素对照品、去氧紫草素对照品、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素对照品各10.00 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，分别以流动相制成质量浓度为0.7，1.0，1.5，1.0 mg／mL的对照品溶液；各精密量取1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成混合对照品溶液。取紫草样品粉末（过60目筛）0.5 g，精密称定，加入6倍量的乙醇溶液于具塞锥形瓶中，室温下密封、遮光。冷浸提取后，过滤，并收集滤液，制成浓缩、干燥的浸膏，加10 mL甲醇使溶解，冷却至室温，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，理论板数按左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫素、β－β′－二甲基丙烯酰紫草素峰计均大于3000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.L－shikonin 2.acetylshikonin 3.deoxyshikonin 4.β－β′－dimethylacryl shikonin A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度试验：取紫草药材样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定6次，记录相对保留时间及色谱峰面积。结果的RSD均小于1.1%（n＝6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：2.2项供试品溶液，室温下放置0，2，4，8，12，18，24，32，40，48 h时按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录相对保留时间及色谱峰面积。结果的RSD均小于2.1%（n＝10），表明供试品溶液室温下48 h内稳定。

重复性试验：取同一批次紫草药材样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录相对保留时间及色谱峰面积。结果的RSD均小于1.4%（n＝6），表明方法重复性良好。

耐用性试验：使用不同型号的仪器、不同批次、不同柱温（28，30，32℃）的色谱柱对同一批次紫草药材样品进行测定，计算其相似度。结果表明，在一定波动范围内，各共有峰的分离度无明显差异，说明指纹图谱测定方法的耐用性良好。

2.4 指纹图谱的建立与评价

2.4.1 紫草指纹图谱的建立

选择10批次紫草药材，分别按上述建立的指纹图谱测定方法进行检测，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.0版）拟合生成对照指纹图谱，以峰面积＞12.5%的10号峰（去氧紫草素）为对照峰，0.5%＜峰面积＜12.5%的分别为第1～9号和第11～14号峰，这14个峰的面积之和占共有峰总面积的90%，详见图2。10批药材对照指纹图谱见图3。

图2 10批药材叠加指纹图谱Fig.2 Superimposed HPLC fingerprints of 10 batches of Arenbiae Radix

图3 10批药材对照指纹图谱Fig.3 Reference fingerprint of 10 batches of Arenbiae Radix

2.4.2 相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.0版）建立共有模式，对图谱数据的相关参数进行自动匹配，生成对照图谱S，计算10批紫草药材提取物图谱与对照图谱间的相似度。结果多超过0.7，见表2。

表2 10批不同产地紫草的HPLC指纹图谱相似度Tab.2 Similarity of HPLC fingerprints of 10 batches of Arnebiae Radix from different producing areas

3 讨论

当前市场紫草品种良莠不齐，2020年版《中国药典（一部）》对药用紫草的描述特征不鲜明，且在紫草指纹图谱方面尚未建立对应的质量规范标准。紫草的市场来源较复杂，实际流通的并非仅药典规定的新疆紫草和内蒙古紫草，还有更多不同的紫草品种无法通过《中国药典》的性状描述准确鉴别［6］。不同的种植地点、采收期、贮藏条件、运输条件等均会对药材产生较大影响，导致现在市场紫草药材的质量难以控制［7］。

为了规范新疆紫草市场，应建立有效的含量测定方法，保证紫草药材质量的有效性和安全性［8］。指纹图谱为全面说明中药化学成分特点的一种新技术，可表征中药样本的特征成分［9］。中药指纹图谱为综合性鉴别方法，其应用范围是鉴别真伪，评价中药的质量均匀性和稳定性［10－11］。采集药材组的指纹图谱，弄清中药材化学成分的多样性和复杂性，是科学合理地控制中药材质量的有效途径［12－13］。本研究结果显示，样品指纹图谱和对照药材指纹图谱中所含化学成分基本相同，但不同市场图谱中特征峰数量和各特征峰面积均存在较大差异，表明新疆紫草萘醌提取物在不同来源的组成相似，但含量差异大。

本研究中建立的紫草指纹图谱用于紫草药材的验收标准，即已明确该药材为紫草的前提下，用指纹图谱控制紫草的入院质量，目的是用于控制入院紫草药材的质量均一性及保证临床疗效的均一性。且本研究建立的指纹图谱虽仅选择了2个大类产区、5个小类产区，指纹图谱的色谱峰选择受到一定限制，但更细化的区分则有利于研究的深入开展。