张志勇，唐爱华，李双蕾，许淑华，高 美

（1.广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530000； 2.广西中医药大学第一附属医院内分泌科，广西 南宁 530000）

近年来，我国糖尿病肾病（DN）发病率呈逐年上升趋势，其中香港DN发病率达31.6%［1］，目前尚无治愈方法，只能通过饮食控制，以及采用降糖、控制血压、减少尿蛋白、护肾等对症治疗，疗效欠佳。研究DN的新靶点和开发新药物成为公众关注的焦点。网络药理学是研究中药活性成分控制基因靶点表达，通过信号通路治疗疾病的新型方法学，是初步探讨中药治疗疾病作用机制的新思路。中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）包含499味草药及每味草药的化合物成分（超29000个），针对每个化合物成分提供了较全面的人体吸收、分布、代谢（ADME）等评价数据，同时提供了潜在活性成分的靶标及其相关疾病信息，形成了针对每味草药的药物－靶标－疾病网络，为从系统水平研究中药作用机理提供了依据［2］。此外，该平台提供了许多中草药的药物代谢动力学数据，如口服生物利用度、药物相似度、肠上皮通透性、血脑屏障、水溶性等，广泛用于药物成分的筛选和评估［3］。本研究中基于TCMSP数据库，通过网络药理学挖掘出黄连治疗DN的基因靶点和信号通路，探析其作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分及其相关靶点

利用TCMSP数据库搜索黄连的所有化学成分，将口服生物利用度（OB）和类药性（DL）作为筛选参数，对药物所有成分进行筛选。设OB＞30%，DL＞0.18［4］，筛选出候选活性成分。选择TCMSP数据库中Related Targets项，可得药物名称等相关靶点信息。

1.2 靶点基因转换

使用Perl语言对所有DN相关的靶点基因进行名称转换，得到靶点基因的标准名称。

1.3 疾病相关基因靶点预测

通过GeneCards和OMIM数据库搜索糖尿病肾病英文名diabetic nephropathy，得到所有与DN相关的靶点基因，作为疾病的候选靶点基因。

1.4 药物靶点基因与疾病靶点基因交集

通过R 3.6.3软件分析出药物和疾病的共同靶点基因，绘制venny图［2］。

1.5 网络构建与分析

将药物和疾病的共同靶点基因导入文件，进行中药网络药理学可视化，利用Cytoscape 3.5.0软件构建网络，可得到疾病－活性成分－靶点基因相互作用的网络图；利用String数据库构建蛋白互作（PPI）网络，用R软件绘制出PPI网络核心基因柱状图，对黄连治疗DN潜在的靶点基因进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 活性成分及其相关基因靶点

通过筛选，共得到14种候选药效成分，主要包含众多生物碱类，详见表1。据此得到所有药物相关靶点信息，并通过转换得到靶点基因的标准名称。

表1 黄连活性成分Tab.1 The active components of Coptidis Rhizoma

2.2 疾病靶点预测

共检索到3273个靶点基因，其中GeneCards数据库3082个，OMIM数据库191个。

2.3 药物靶点基因与疾病靶点基因交集

共得到101个靶点基因。

2.4 网络构建

疾病－活性成分－靶点基因相互作用的网络图中可发现6个治疗DN的关键有效活性成分，分别为小檗碱、小檗红碱、表小檗碱、槲皮素、黄连碱、甲基黄连碱（见图1）。PPI网络图中共有101个节点，1680条作用连线，平均节点度33.3，平均局部类聚系数0.673。PPI网络核心基因柱状图见图2。

图1 疾病－活性成分－靶点基因网络图Fig.1 Disease－active components－target genes network

图2 PPI网络核心基因柱状图Fig.2 PPI network histogram of core genes

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析图见图3，KEGG富集分析图见图4。可见，黄连治疗DN涉及靶点的生物学功能及信号通路众多，但与DN密切相关靶点的生物学功能涉及受体结合、酶的活性、氧化还原等，主要富集在细胞因子受体结合、受体配体活性、DNA结合转录激活剂活性和RNA聚合酶Ⅱ特异性、细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、丝氨酸水解酶活性、激酶调节活性、氧化还原酶活性，作用于成对的供体，与分子氧结合或还原等（见表2）。密切相关的信号通路主要包括AGE－RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、缺氧诱导因子－1（HIF－1）信号通路（见表3）［3］。

图3 GO功能富集分析图Fig.3 GO function enrichment analysis diagram

图4 KEGG富集分析图Fig.4 KEGG enrichment analysis diagram

表2 黄连治疗DN的靶点功能信息Tab.2 Target function information of Coptidis Rhizoma in the treatment of DN

表3 黄连治疗DN的主要通路信息Tab.3 The main pathway information of Coptidis Rhizoma in the treatment of DN

3 讨论

中医称糖尿病为消渴病，DN由消渴日久发展而来，饮食无度、胃强脾弱、脾气虚、太阴湿阻、郁阻中焦、气机壅滞、化为燥热、消竭肾水、阴虚火旺、引起下焦湿热损伤肾络；肾虚阴阳失衡，气化失司，水液潴留。黄连具有降血糖、消炎、抗氧化、调血脂等作用，能清邪热，化水湿，《名医别录》中记载黄连“主治五藏冷热……止消渴”，《本草纲目》中指出其主治“消渴尿多”“小便如油”［4］。有研究表明，黄连可激活蛋白激酶、抑制肝脏将非糖物质转化为葡萄糖、促进B细胞修复、促进胰岛素受体相关基因表达、提高胰高血糖素样肽－1（GLP－1）水平等，从而发挥降血糖效果［5］。黄连所含黄连总生物碱能降低DN模型大鼠肿瘤坏死因子－α（TNF－α）和肌酐水平，改善肾组织细胞损伤［6］。长期应用黄连可逐渐缓解肾小球病理改变，延缓疾病进程，从而达到治疗DN的目的［7］。黄连及其复方不仅控制血糖、血压效果较佳，在调节脂质代谢紊乱和减少蛋白尿排泄方面也有显著疗效［8］。

小檗碱、槲皮素是黄连治疗DN的主要活性成分。由疾病－活性成分－靶点基因网络图可见，小檗碱、槲皮素所控制的靶点基因也是DN的靶点基因，说明小檗碱、槲皮素可通过这些靶点基因改善DN症状。小檗碱可通过磷脂酰肌醇－3激酶／蛋白激酶（PI3K／AKT）途径降低体内PI3K、磷酸化AKT水平，改善肾功能，抑制足细胞功能障碍，从而治疗DN［9］；槲皮素是黄酮类化合物，对链脲佐菌素（STZ）诱导的DN大鼠有抗氧化作用［10］；表小檗碱、黄连碱可抑制醛糖还原酶活性，能预防糖尿病并发症，但未明确指出可治疗DN［11］。目前未见小檗红碱、甲基黄连碱治疗DN的文献报道，需进一步研究。说明连治疗DN具有多成分的特点。

由PPI网络图中可见，节点数排列前10的基因分别为蛋白激酶1（AKT1）、白细胞介素6（IL－6）、血管内皮因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、JUN原癌基因（JUN）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2或COX－2）、表皮生长因子（EGF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、基质金属蛋白酶9（MMP－9）、表皮生长因子受体（EGFR）等，推测这些基因可能是黄连干预DN的主要基因靶点。余红等［12］研究发现，减弱AKT1蛋白的表达，能部分抑制肾小管上皮细胞的转分化过程，减少纤维连接蛋白（FN）沉积，改善DN。IL－6是趋化因子家族的一种细胞因子，在DN发病过程中扮演着重要角色。IL－6－174G／C基因多态性与DN的风险相关［13］。在高糖环境诱导下，IL－6可能通过激活Janus kinase2（JAK2）／STAT3信号通路，对足细胞肥大的形成起到重要作用，从而加速DN的发展［14］。CASP基因是半胱氨酸家族的一部分，在细胞的衰老、凋亡等生理过程中起重要作用。ELENA等［15］发现，DN的生理病理机制有着和细胞损伤、凋亡一样特征的超微机构变化，认为DN的发生与发展可能与CASP基因相关。COX－2与DN有关，其在肾脏中的上调会导致肾小球损伤和蛋白尿的产生，选择性抑制COX－2可延缓肾损伤的进展［16］。尿液EGF与DN进展密切，在区分早期DN和临床DN，以及在非DN患者中区分微量蛋白尿时显示了良好的应用价值，提示EGF可作为DN的特异性诊断标志物［17］。说明黄连治疗DN具有多靶点特点。

黄连的活性成分通过AGE－RAGE、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF－1等信号通路治疗DN［5］。小檗碱可中断AGE－RAGE信号通路，降低细胞中AGEs和RAGE水平，并能抑制细胞膜增殖［18］。槲皮素可抑制AGE－RAGE信号通路，减少血管损害，降低蛋白尿水平［19］。流体剪切应力代表血流施加在血管内皮的摩擦力，低流体剪切力有助于血管动脉粥样硬化的发展［20］。现代药理学研究表明，小檗碱具有多种药理活性，包括降血糖、调血脂、抗炎等活性，可发挥抗动脉粥样硬化作用，此外，小檗碱的抗炎和抗氧化特性能抑制血管平滑肌细胞增殖和改善内皮功能障碍［21］，从而改善肾脏血流，增加流体剪切力，达到治疗DN的目的。HIF－1信号通路在炎性反应中激活VEGFA的表达，以抵消缺氧，并防止肾脏组织损伤［22］。VEGFA在DN的发病机理中起重要作用，过表达将促进微血管内皮细胞的增殖，并加剧血管疾病的发生。KALLINIKOU等［23］研究表明，VEGFA可作为生物标志物识别DN的进展，并在DN患者的血浆和尿液中具有较高的表达水平。小檗碱能激活HIF－1A信号通路，抑制DN模型大鼠的肾小管上皮细胞凋亡［24］；槲皮素能通过调节HIF－1A和VEGFA水平改善肾功能，降低蛋白尿水平［25－26］。

综上所述，本研究从分子学角度出发，运用网络药理学方法，分析黄连的中药活性成分，挖掘出治疗DN的靶点基因，发现黄连是通过小檗碱、槲皮素等成分，AGE－RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、HIF－1信号通路等来治疗DN。但本研究范围仅局限于数据库，仍需进一步进行临床试验验证。