吕双娟，舒林娟，林啟研，李思颖，李丹宁，肖越，莫显明

(四川大学华西医院干细胞生物学研究室，成都610041)

基因编辑技术是研究动物基因功能和物种进化基因规律的有效手段，其中最方便的基因编辑技术是CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9是一种在细菌和古细菌体内由sgRNA和Cas9蛋白组成复合体(Deltchevaetal.，2011)以抵御外源DNA的适应性免疫防御系统(Horvath & Barrangou，2010；Wiedenheftetal.，2012)。CRISPR/Cas9技术在生物医学等领域有着广泛的应用，已经成功地在多个物种中实现了基因组编辑，如斑马鱼Daniorerio(Changetal.，2013；Hwangetal.，2013a，2013b；Xiaoetal.，2013；Yinetal.，2015；Brocaletal.，2016；Gasanovetal.，2021；Shaw & Mokalled，2021)。CRISPR/Cas9复合体通过碱基互补配对识别并与外源靶DNA的互补序列结合，在靶DNA的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)区上游3 bp引入双链断裂并通过非同源末端连接或同源定向修复以实现基因的特定编辑(Jineketal.，2012；Congetal.，2013；Jiangetal.，2013；Malietal.，2013)。CRISPR/Cas9基因编辑系统依赖于sgRNA的识别序列与靶点序列的特异性结合。可以通过改变sgRNA序列来增加CRISPR/Cas9系统的靶效应，例如截断sgRNA的5’端碱基(Choetal.，2014；Fuetal.，2014)或在sgRNA的5’端增加2个G(Choetal.，2014)均可以降低脱靶效应；在斑马鱼体内针对同一基因使用2个sgRNAs造成目的基因的基因组大片段缺失(Xiaoetal.，2013；Hoshijimaetal.，2019)或者针对同一目标位点使用2个互补的sgRNA(Gasanovetal.，2021)可显著提高CRISPR/Cas9的突变效率。然而，由于基因组的复杂性和sgRNAs对特定碱基错配的忍耐性(Bolukbasietal.，2016)，sgRNA的识别序列同样可能与其他非靶DNA序列部分匹配，激活Cas9核酸内切酶活性，导致脱靶效应，从而降低靶DNA的切割活性(Yannietal.，2014；Ewaetal.，2018)。因此，对sgRNA进行特异性和高效性预测具有重要意义。

本研究分析了针对斑马鱼35个基因的157个sgRNAs的序列组成，发现高效的sgRNA具有序列组成偏好性，能够最大化提高CRISPR/Cas9系统的切割效率。此外，对已发表的sgRNA序列特征进行重新分析以验证本研究所获得的序列特征是否具有普遍适用性，便于优化用于CRISPR/Cas9基因编辑和遗传筛选的sgRNA设计。……