张 濛，续高山，滕志远，刘关君，张秀丽，3*

(1.东北林业大学生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 150040；2.林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),黑龙江哈尔滨 150040;3.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室(东北林业大学)，黑龙江 哈尔滨 150040)

对于植物而言，酸雨已成为常见的非生物胁迫之一，不同的植物对于酸雨胁迫的响应不同[1-2]，当酸雨的酸度超过植物的耐受极限时，植物叶片会出现变黄、脱落、衰老甚至死亡等现象[3]。更多的研究表明，植物通过调整体内生理生化过程应对酸雨胁迫表现出一定的耐受性。光合作用是植物体内重要生理过程，电子传递过程中容易受逆境胁迫而产生过剩的活性氧，一部分活性氧被活性增强的抗氧化酶消除[4]，一部分则与植物细胞内的抗氧化物质[维生素E(VE)、维生素C(VC)]结合[5]。而过剩活性氧可能会破坏光合机构[6]，常表现为光能利用率下降[7]和光合电子传递受阻[8]等，造成植物光合能力减弱。研究发现：重度酸雨(pH≤3.5)处理的桑树(Morusalba)叶片光系统Ⅱ活性和电子由QA到QB传递受阻[9]；而适度的酸雨胁迫(pH≥4.5)可促进桑树叶片瞬时净光合速率，缓解光合午休，而其光系统Ⅱ电子传递并未受到限制[10]。

小黑杨(Populussimonii×P.nigra)适应能力很强，且具有生长迅速、成林早等优良性状[11]，在工业用材、植被防护、涵养水源、固碳储碳、改善气候等方面发挥重要作用，广泛种植于我国三北地区[12]。目前关于逆境对杨树生长及生理特性的研究多集中在低温[13]、盐胁迫[14-15]及干旱胁迫[16]等方面。国内关于酸雨对杨树生长影响的研究较少，仅有酸雨对欧美杨南方型‘1-72’杨(Populus×euramericana)的生长及木材化学性质的影响[17]和白毛杨(Populustomentosa)生长及敏感性[18]的报道，有关小黑杨保护酶和光系统Ⅱ活性对于酸雨响应情况的相关报道较少。叶绿素荧光技术被称为光合作用研究的探针，可无损、快速地反映光合作用过程。因此，本研究以小黑杨幼苗生长指标及叶片结构及部分活性氧、抗氧化物酶和叶绿素荧光参数为研究内容，探讨小黑杨对于酸雨的响应状况，以期为在酸雨沉降日趋严重的北方地区[19]合理栽植小黑杨提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用小黑杨(P.simonii×P.nigra)最早是由中国林业科学研究院林业研究所人工杂交育成。本研究所用小黑杨插条取自东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室实验林场(126°62.87′E，45°71.97′N)，从同一株小黑杨插条获得的幼苗，截顶生根后移至蛭石中，浇灌1/2 Hoagland营养液[20]。试验于2017年4月20日在东北林业大学植物生理室外酸雨棚中进行。

1.2 试验设计

1.3 测定方法

快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的测定：试验对象为不同处理下长势相对一致的3株幼苗(即3次重复)。试验仪器选择Mini调制式掌上叶绿素荧光仪(FluorPenFP100max，捷克)。首先对小黑杨幼苗顶端向下数第4片叶(完全展开)进行暗处理30～45 min。然后，根据测得的数据绘制0.01～1 000.00 ms的OJIP曲线，同时对OJIP曲线进行JIP-test分析[21]。根据公式，以时间为横坐标、相对荧光值为纵坐标分别绘制标准化O-P、O-K、O-J曲线。为使各处理与对照之间的差异更加直观、准确，分别将pH 4.5和pH 2.5酸雨处理标准化O-P、O-J和O-K曲线与CK之间作差，并分别用ΔVO-P、ΔVO-J与ΔVO-K表示。

VI= (Ft-Fo)/(FI-Fo)，

VJ= (Ft-Fo)/(FJ-Fo)，

VK= (Ft-Fo)/(FK-Fo)，

VL= (Ft-Fo)/(FL-Fo)。

其中：O、L、K、J、I、P点分别代表曲线上0、0.15、0.3、2.00、30.00和1 000.00 ms所对应的荧光强度，分别用FO、FI、FJ、FP、FK和FL表示对应点的相对可变荧光强度；VJ、VI、VK和VL分别是各时间点(t)的相对可变荧光值。

生长指标测定：对已测OJIP曲线对应小黑杨幼苗，进行株高、茎粗、叶片数和叶面积测定。株高和茎粗分别利用直尺和游标卡尺进行测定；记录各组小黑杨幼苗的叶片数，并用叶面积仪(Li-3000，美国)测量叶面积。

透射电镜样品制备：分别将切好的小黑杨幼苗叶片样品(1 mm×1 mm×1 mm)用戊二醛和四氧化锇固定液进行前固定与后固定，之后利用体积分数为50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液对其进行梯度脱水，再经浸透包埋、聚合、修块、定位和染色，利用透射电子显微镜(JEM-2100, 日本)对样品进行观察和拍照。

1.4 数据处理

运用SPSS 16.0和Excel 2007软件对数据进行统计分析和作图，利用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析，用3次重复数据的平均值±标准差作图。

2 结果与分析

2.1 酸雨胁迫对小黑杨叶片表型及其内部超微结构的影响

模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗叶片表型及其解剖结构发生了明显变化(图1)：对照(CK)小黑杨叶片翠绿(图1 A1)，叶绿体结构完整，类囊体排列紧凑，内部分布着数量多、体积大的淀粉粒(图1 B1、 C1)。pH 4.5模拟酸雨处理下，小黑杨叶片颜色转呈黄绿色(图1 A2)，但其叶绿体结构完整，类囊体排列正常，未见淀粉粒，可见少数嗜锇滴(图1 B2、C2)；而pH 2.5模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗叶片变黄程度加重，且叶尖和叶脉出现明显的坏死病斑(图1 A3)，其内部细胞膜局部破裂，类囊体片层结构紊乱，嗜锇滴颗粒数量和体积明显增多，淀粉粒数量少、体积小、色灰暗(图1 B3、C3)。

A.叶片leaf;B.细胞cell;C.叶绿素chloroplast;Chl. 叶绿体 chloroplast；ChM. 叶绿体膜 chloroplast membrane；GL. 基粒片层 grana lamellae；OS. 嗜饿滴 osmiophilic；SG. 淀粉粒 starch grain；SL. 基质片层 stroma lamellae；CW. 细胞壁 cell wall. A1.对照CK；A2.pH 4.5；A3.pH 2.5；B1.对照CK；B2.pH 4.5；B3.pH 2.5；C1.对照组CK；C2.pH 4.5；C3.pH 2.5。图1 模拟酸雨对杨树叶片表型和解剖结构的影响Fig.1 Effects of simulated acid rain on leaf phenotype and internal anatomy of Populus simonii ×P. nigra

模拟酸雨对小黑杨幼苗生长指标的影响如表1所示。其中，pH 4.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗的株高、茎粗和叶片数较CK高出了23.09%(P< 0.05)、1.03%(P> 0.05)和36.84%(P< 0.05)，叶面积较CK降低了3.18%(P> 0.05)；而在pH 2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗的株高和叶片数较CK变化较小。

表1 模拟酸雨对小黑杨幼苗生长指标的影响

2.2 酸雨胁迫对小黑杨叶片部分氧化和抗氧化指标的影响

表2 模拟酸雨对小黑杨幼苗叶片部分氧化和抗氧化指标的影响

2.3 酸雨胁迫对小黑杨叶片叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的影响

模拟酸雨胁迫改变了小黑杨幼苗叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的形态(图2)。pH 4.5模拟酸雨处理的FO、FJ、FI、FP较CK分别升高了18.12%(P< 0.05)、13.30%(P< 0.05)、9.03%(P< 0.05)和9.33%(P< 0.05)；在pH 2.5模拟酸雨处理下，FO、FJ、FI、FP较CK分别升高了38.01%(P< 0.05)、20.22%(P< 0.05)、10.17%(P< 0.05)和8.21%(P< 0.05)。

将OJIP曲线进行标准化及标准化后做差发现，pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗的荧光参数VJ和VI略高于CK，但与CK差异不显著性(P> 0.05)；而pH 2.5模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗叶片的VJ和VI较CK分别升高了10.26%(P< 0.05)和1.67%(P< 0.05)，其中，VJ升高幅度大于VI。

不同小写字母表示在0.05水平上相同参数在不同处理间差异显著。下同。Data in the figure are mean ±SD, values followed by different small letters mean significant differences (P <0.05). The same below.图2 模拟酸雨对杨树幼苗叶片OJIP曲线的影响Fig.2 Effects of simulated acid rain on OJIP curve in the leaves of Populus simonii × P. nigra stecklings

图3 模拟酸雨对小黑杨幼苗叶片标准化O-K和O-J曲线的影响Fig.3 Effects of simulated acid rain on standarded O-K and O-J curve in leaves of Populus simonii × P. nigra stecklings

模拟酸雨处理显著提高了小黑杨幼苗叶片L点和K点的可变荧光强度(图 3)。其中，pH 4.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FL和FK与CK相比分别升高了20.51%(P< 0.05)和18.07%(P< 0.05)，pH 2.5模拟酸雨处理下小黑杨幼苗叶片的FL和FK较CK分别升高了43.22%(P< 0.05)和37.11%(P< 0.05)。将O-K曲线与O-J曲线标准化后可以发现，pH 4.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的VL和VK与CK相比分别升高了5.31%(P< 0.05)和9.85%(P< 0.05)；pH 2.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的VL和VK与CK相比分别升高了12.12%(P< 0.05)和21.16%(P< 0.05)。

2.4 酸雨胁迫对小黑杨叶片PSⅡ光化学活性的影响

不同pH的模拟酸雨处理均使得小黑杨幼苗叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)和以光吸收为基础的光合性能指数(PIABS)显著下降(表3)。在pH 4.5模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗叶片的Fv/Fm和PIABS较CK分别降低了2.21%(P< 0.05)和23.98%(P< 0.05)。小黑杨幼苗叶片的QA被还原的相对速率(MO)和荧光曲线与Fm之间的面积(Fix Area)与CK相比分别升高了12.34%(P> 0.05)和6.94%(P< 0.05)，PSⅡ受体侧的电子受体库容量(Sm)降低了19.54%(P> 0.05)；在pH 2.5模拟酸雨处理下，小黑杨幼苗叶片的Fv/Fm和PIABS较CK分别降低了5.58%(P< 0.05)和52.30%(P< 0.05)。小黑杨幼苗叶片的M0、Fix Area与CK相比分别升高了33.51%(P< 0.05)和8.48%(P< 0.05)，Sm降低了24.32%(P< 0.05)。

表3 模拟酸雨对小黑杨幼苗叶片光系统Ⅱ活性参数的影响

3 讨 论

研究发现，适度的酸雨有利于茶树(Camelliasinensis)[34]和马尾松(Pinusmassoniana)[35]的生长。pH 4.5模拟酸雨处理的小黑杨幼苗叶片OJIP曲线上出现K点和L点，可能原因在于模拟酸雨持续喷施至检测时，小黑杨幼苗叶片的PSⅡ电子传递在供体侧受到影响，放氧复合体发生了可逆性失活。但主要荧光参数MO、Sm、VJ和VI与CK之间差异均不显著，说明PSⅡ电子传递受体侧未受明显影响。同时，小黑杨的生长指标包括株高、茎粗、叶片数和叶面积均明显高于CK。其可能的原因是适度酸雨(pH ≥ 4.5)作为矿质营养物质参与小黑杨代谢，有利于小黑杨的生长。

综上所述，pH 2.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片的活性氧含量明显增加，PSⅡ的受伤程度较为明显，发生了不可逆的光抑制，原因在于PSⅡ中受体侧放氧复合体OEC受到损伤，以及光合电子从QA向QB的传递受阻；pH 4.5模拟酸雨处理小黑杨幼苗叶片仅PSⅡ电子传递供体侧受到抑制，而其他荧光参数、株高和叶片数均显著高于对照。小黑杨对短期内酸雨(pH ≥ 4.5)胁迫具有一定的抗性，且适度pH的酸雨有利于小黑杨生长。