何瑞娟 李晓良 杜雨辰 白露 谈旭

1.濮阳医学高等专科学校教务处，河南 濮阳 457000 2.濮阳市中医院骨科，河南 濮阳 457000 3.濮阳市人民医院药剂科，河南 濮阳 457000

骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作为骨质疏松症(osteoporosis，OP)最严重的并发症，严重威胁着中老年人群的身心健康和生活质量[1-2]。因此，探索行之有效的药物研究有着非同寻常的意义，随着祖国传统医学的发展，中药治疗骨质疏松及骨折历史悠久，具有疗效确切、不良反应少等优点。中草药仙灵骨葆胶囊可促进骨形成，抑制骨吸收，降低骨转换，加速骨折早期骨痂形成，促进骨折愈合，临床用于OP和OPF的预防和治疗[3]。阿仑膦酸钠是以OP为适应证而获准上市的第3代双膦酸盐类药物，增加骨量，提高骨强度，降低骨折发生概率[4]。目前中西医结合防治OPF，可减少不良反应和毒副作用的发生。本研究旨在探讨通过动物实验观察仙灵骨葆胶囊联合阿仑膦酸钠对骨折愈合过程VEGF和BMP-2表达及血管形成的影响，探索其潜在的作用机制，为中西医结合防治OPF提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

1.1.1实验动物：健康3月龄Sprague-Dawley雌性大鼠75只，体重为(252.53±30.32)g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2017-0001，饲养于郑州大学实验动物中心，温度(23±3)℃，室温(25±2)℃，相对湿度(60±5)%，12 h明暗光照交替，自由进食水，紫外线定期消毒，适应性饲养1周后进行实验。严格遵循实验动物伦理，各组大鼠均分笼饲养，饲养环境条件均相同。

1.1.2实验药物及试剂：仙灵骨葆胶囊[0.5 g/粒，国药准字：Z20025337，生产批号：141226，国药集团同济堂(贵州)制药有限公司]，阿仑膦酸钠片(福善美)(70 mg*1 s，生产批号：J20170085，美国默沙东制药有限公司)。兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗体购于德国ChromoTek公司，XR-36型双能X线骨密度仪(DXA)购于美国NORLAND公司，计算机X射线摄像仪购于日本Konica Minolta公司，SkyScan1278 micro-CT购于德国布鲁克公司，Olympus BX53光学显微镜购于上海富莱光学科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1构建去卵巢骨质疏松性骨折模型：参照文献方法构建去卵巢大鼠骨质疏松性骨折模型的建立与内固定方法[5]。麻醉、备皮、消毒、铺巾，背侧后方髂骨棘上2 cm取纵行切口1 cm，逐层分离，暴露腹腔，切除卵巢，以丝线将残端结扎输卵管，关闭后腹膜，逐层缝合关闭切口，假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织。4周后经检测各组大鼠右侧股骨骨密度，以确定模型制备成功。再次麻醉后右侧股骨中段外侧2 cm纵行切口，沿股外侧肌间隙钝性分离，显露股骨干，线锯锯断股骨干中1/3段成横行骨折，克氏针逆行穿入骨折近端髓腔且穿出股骨髁，复位骨折后再将其顺行穿入骨折远段髓腔，固定牢靠后在股骨髁处截断多余克氏针，生理盐水冲洗，逐层关闭伤口。术后给予庆大霉素8万U肌肉注射，连续3 d。

1.2.2实验分组：本实验在造模期间无动物死亡，所有动物经X射线骨密度仪筛选均合格。将50只大鼠按随机数字法分为：假手术组(SHAM组)、模型组(MODEL组)、仙灵骨葆组(XLGB组)、阿仑膦酸钠组(ALLSN组)、联合药物组(LHYW组)，每组10只。XLGB组：仙灵骨葆胶囊，0.25 mg/kg，ig，1次/d；ALLSN组：阿仑膦酸钠片0.25 mg/kg，ig，1次/周；LHYW组：仙灵骨葆胶囊，0.25 mg/kg，ig；阿仑膦酸钠片0.25 mg/kg，ig，1次/周；SHAM组和MODEL组：等量0.9% NaCl，ig，1次/d，连续给药8周。

1.2.3标本采集与处理：建模8周后行计算机X射线摄像仪摄片后，采取脱颈法处死各组大鼠，10%水合氯醛麻醉，摄片后采用急性大失血法处死，取出右侧股骨，完整分离右侧整段股骨及骨痂，截取以骨折处为中点长约2 cm股骨，0.9%生理盐水冲洗，先检测骨密度，10%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇过夜，待micro-CT检测，另取部分股骨，10%EDTA-2Na脱钙5周，每周更换脱钙液，脱水透明，石蜡包埋，5 μm连续切片，60 ℃烤箱备用。

1.2.4计算机X射线摄像仪摄片(CR)：取出右侧股骨干，采用CR摄片，参数：电流3.2 mA/s，电压40 kV，距离90 cm，观察骨折断端骨痂连续性及骨折愈合情况。

1.2.5双能X线吸收(DEXA)法检测骨密度：取出待测股骨，将右侧全长股骨3等分，采用小物体扫描模式，分别检测股骨远1/3段骨密度(dBMD)和中1/3段骨密度(mBMD)和全长骨密度(tBMD)，参数：准确度0.01%，扫描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，扫描宽度5.0 cm，连续测量BMD各5次。

1.2.6Mirco-CT检测骨痂结构形态学参数：采用Micro-CT-40对骨痂感兴趣区域进行扫描，参照机器操作步骤，参数设置，扫描范围：上下界范围：以骨折线为中心向上下分别取381层轴位片，外侧范围：可见的骨痂最外侧骨性轮廓，内侧范围：股骨外侧缘，重构图像数据后使用CT Analyser骨微结构分析，相关参数：骨小梁数量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.Th)、骨小梁分离度(Th.Sp)和骨小梁骨体积分数(BV/TV)。

1.2.7番红O固绿染色观察骨痂组织形态学：使用改良番红固绿试剂盒中的试剂按操作流程进行染色，二甲苯脱蜡，无水酒精及酒精水化，Weigert A液和Weigert B液等比例混合，染核3 min，盐酸乙醇分化溶液中分化1 min；流水冲洗反蓝，滴加固绿染液，乙酸溶液分化30 s。1%番红O染液染6 min，95%乙醇溶液分化，直到骨性组织番红染液褪去，与软骨组织区分明显后终止分化。再次脱水，透明，封片。随机选择5张矢状位的不连续切片，Olympus光镜下观察骨小梁的形态结构。

1.2.8免疫组织化学(SP)法检测骨痂VEGF和BMP-2表达：参照SP法实验步骤进行操作[6]。严格按试剂盒说明书进行，标本切片脱蜡至水，0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加兔抗鼠多克隆抗体BMP-2和VEGF(1∶400)50 μm，置于湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS液替代一抗作为阴性对照。滴加生物素化抗兔二抗(1∶400)，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明和封固。光学显微镜观察并采集涂片，以细胞膜、细胞浆呈棕黄色或棕黑色反应为阳性反应，统计阳性细胞积分吸光度值进行IRS半定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

50只实验大鼠均进入实验结果分析。

2.1 各组大鼠右股骨X线分析结果

SHAM组骨折线模糊，骨皮质完整，断端有明显的骨痂形成，形成坚实致密的高密度骨影。MODEL组骨折线清晰可见，断端未出现连接，均无不愈合迹象，骨痂骨性骨影较少。XLGB组和ALLSN组骨折线较模糊，断端可见部分膨大骨痂形成，并未完全连接。LHYY组骨折线模糊，骨折痕迹基本消失，骨痂体积和量较多，形成纤维包绕。与SHAM组(4.573±0.220)比较，MODEL组(2.608±0.135)骨折愈合评分显著降低(P<0.05)；与MODEL组比较，XLGB组(3.953±0.215)、ALLSN组(4.058±0.288)和LHYY组(4.320±0.235)骨折愈合评分均显著升高(P<0.05)，尤以LHYY组最高。见图1。

图1 X线观察各组大鼠右股骨骨折愈合情况A：SHAM组；B：MODEL组；C：XLGB组；D：ALLSN组；E：LHYY组Fig.1 X-ray observation of the healing of the right femoral fractures of rats in each groupA: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.2 各组大鼠右股骨骨密度测量结果

与SHAM组比较，MODEL组大鼠右侧股骨tBMD、dBMD和mBMD均显著降低(P<0.05)；与MODEL组比较，XLGB组、ALLSN组和LHYY组大鼠右侧股骨tBMD、dBMD和mBMD均显著升高(P<0.05)，尤以LHYY组最高。见表1。

表1 各组大鼠右股骨BMD比较

2.3 各组大鼠右股骨骨组织形态学参数分析

与SHAM组比较，MODEL组大鼠右股骨BV/TV、TB.N、TB.Sp和TB.Th均显著降低(P<0.05)；与MODEL组比较，XLGB组、ALLSN组和LHYY组大鼠右股骨BV/TV、TB.N、TB.Sp和TB.Th均显著升高(P<0.05)，尤以LHYY组最高。见图2和表2。

表2 各组大鼠右股骨结构形态参数比较Table 2 Comparison of morphological parameters of the right femur of rats between each group

图2 各组大鼠右股骨Mirco-CT重建图像A：SHAM组；B：MODEL组；C：XLGB组；D：ALLSN组；E：LHYY组Fig.2 Micro-CT reconstructed image of the right femur of rats in each groupA: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.4 各组大鼠右股骨骨痂组织形态学观察结果

SHAM组骨小梁结构正常，密聚，粗细均匀，相互联接成网状，可见板层骨形成，并向骨性骨痂转换。MODEL组骨小梁明显稀疏断裂，排列紊乱，骨髓腔扩大，网状结构破坏，结构疏松，未见骨性骨痂。XLGB组和ALLSN组骨小梁增多，排列稍紊乱，大部分为骨性骨痂。LHYW组骨小梁明显增多，粗细较均匀，排列密集整齐，相互联接成网状结构，几乎均为骨性骨痂。见图3。

图3 番红固绿染色观察各组大鼠右股骨骨痂组织形态学(40×)A：SHAM组；B：MODEL组；C：XLGB组；D：ALLSN组；E：LHYY组Fig.3 Safranin fast green staining to observe the morphology of the right femoral callus of rats in each group (40×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.5 各组大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表达

VEGF主要表达于骨痂组织成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞，BMP-2主要表达于骨痂组织成骨细胞和骨小梁的边缘。与SHAM组比较，MODEL组大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表达均显著降低(P<0.05)；与MODEL组比较，XLGB组、ALLSN组和LHYY组大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表达均显著升高(P<0.05)，尤以LHYY组最高。见图4、5和表3。

图4 免疫组化观察各组大鼠右侧骨痂VEGF表达(200×)A：SHAM组；B：MODEL组；C：XLGB组；D：ALLSN组；E：LHYY组Fig.4 Immunohistochemical observation of the expression of VEGF in the right callus of rats in each group (200×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

图5 免疫组化观察各组大鼠右股骨骨痂BMP-2表达(200×)A：SHAM组；B：MODEL组；C：XLGB组；D：ALLSN组；E：LHYY组Fig.5 Immunohistochemical observation of BMP-2 expression in right femoral callus of rats in each group (200×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

表3 各组大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表达

3 讨论

中医理论将OP归属为“骨痿、骨痹、骨枯”等范畴[6]。中医学认为肾主骨，肾藏精，精生髓，髓生骨，骨枯髓减，发为骨痿，精足则髓足，髓足则骨强，肾精亏虚，骨髓无源，骨骼痿弱[7-8]。中医药防治OP紧紧围绕肾主骨生髓理论[9]。仙灵骨葆胶囊是由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参、地黄等多味中药组成传统纯中药制剂，方中淫羊藿为主药，配以续断、补骨脂、知母、丹参、地黄等为佐使药，全方共奏补肾滋阴、补肾壮阳坚筋骨、活血通络和强筋壮骨，诸药合用共奏防治“骨枯”之功效[10-11]。仙灵骨葆胶囊具有雌激素样作用，促进成骨细胞增殖、分化，调节骨代谢，增加骨量骨密度，降低骨高转换率，防止骨质疏松，同时能增加骨折局部血流量，加速骨痂形成，促进骨质修复和加快骨重建[12-13]。

骨折愈合是骨连续性恢复和骨结构强度的重新获得，是一系列复杂有序的骨组织再生过程[14]。研究表明血管生成与骨折愈合关系密切，新血管形成、恢复骨折断端血供是骨折修复的前提，新血管生成提供骨愈合所需要的营养及各种成骨细胞成分[15]。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为机体内作用最强高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能促进血管内皮细胞增殖，维护血管正常状态及完整性，促进新血管生成，同时还可促进血管微环境生长因子的表达，对骨的形成和重建有功能性的作用[16-17]。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨折愈合关键性骨生长细胞因子，诱导未分化间充质细胞分化为成软骨细胞和成骨细胞，促进成骨细胞分化增殖，激活成骨细胞活性，增加骨量骨密度，加速骨重建骨形成，促进骨折愈合[18]。

本研究结果表明MODEL组较SHAM组大鼠骨折愈合评分、骨密度、骨组织形态学参数、骨痂VEGF和BMP-2表达均显著降低(P<0.05)，与MODEL组比较XLGB组、ALLSN组和LHYY组骨折愈合评分、骨密度、骨组织形态学参数、骨痂VEGF和BMP-2表达均显著升高(P<0.05)，尤以LHYY组最高。SHAM组骨小梁结构正常，几乎均为骨性骨痂。MODEL组骨小梁明显稀疏、断裂，未见明显骨性骨痂。XLGB组和ALLSN组骨小梁增多，排列稍紊乱，大部分为骨性骨痂。LHYW组骨小梁明显增多，排列密集整齐，大量骨性骨痂。说明仙灵骨葆胶囊联合阿仑膦酸钠可能通过介导提高骨质疏松性骨折大鼠骨生长因子VEGF和BMP-2表达，促进骨痂血管形成，加速骨痂形成，增加骨密度，改善骨结构形态，促进骨折愈合。吴继云等[19]研究发现仙灵骨葆胶囊可能通过提高骨折周围软组织TGF-β和VEGF表达，促进骨质疏松性骨折大鼠骨折愈合过程。田发明等[20]研究发现仙灵骨葆胶囊可通过提高骨质疏松骨折大鼠BMP-2表达，以增加骨痂局部血流量，加速骨痂血管形成，促进骨折愈合。周油山等[21]研究发现仙灵骨葆联合阿仑膦酸钠能够降低骨质疏松症患者骨转换生化水平，提高骨密度，显著提升治疗有效率，疗效确切，无严重不良反应。李明等[22]研究仙灵骨葆胶囊联合阿仑膦酸钠片可有效地改善骨质疏松患者临床症状、提高生活能力。

综上所述，仙灵骨葆胶囊联合阿仑膦酸钠可促进骨质疏松性骨折大鼠骨痂血管形成，加速骨痂形成，增加骨密度，改善骨结构形态，促进骨折愈合，其作用机制可能通过介导骨生长因子VEGF和BMP-2表达密切相关。虽然联合用药临床及实验研究均取得较大的进展，但本研究仅是初步结果，其具体作用机制目前尚未完全清楚，还有待于进一步研究，中西结合为防治OPF提供了新的思路，但中药及其复方制剂成分及作用机制复杂，应将传统医学辩证论治、整体调理的优势和现代医学理论充分结合起来，探讨中西结合防治OP是未来研究的重点，为临床治疗及新药研发提供依据，推动祖国传统医学的可持续发展，同时也为中草药的应用开辟新的途径。