薛甜霞 张冉 徐源佑 许佳敏 李海娟 王洁 边海霞

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2021.11.038

摘要：试验采用肠道剖检、细菌分离技术、细菌基因组测序与药敏试验等方法进行探讨，首先从剖检变化、菌落、菌体的形态、基因测序等方面对病原菌进行了鉴定，肠道剖检过程中可见肠管体积增加，内部臌气，肠内容物呈类西红柿样和类褐绿色样。通过染色镜检观察显示为两端钝圆，呈杆状，蓝紫色。从菌落的形态学观察，TSC-卵黄平板上呈现有白浊环的圆形的黑色菌落。进行序列测定后提示此次分离得到的菌株与产气荚膜梭菌同源性较高，其次经药敏结果说明其对阿莫西林等5种测试药物高度敏感，对盐酸土霉素中敏，对硫酸新霉素等3种药物耐药。通过对宁夏蛋鸡场坏死性肠炎疑似病例的病原及临床防控研究，此次共分离到一株产气荚膜梭菌，阿莫西林、氨苄青霉素、地美硝唑、盐霉素与多西环素对该分离菌株有良好的抑制效果，而磺胺间甲氧嘧啶、硫酸新霉素与地克珠利则对分离菌株无抑制作用。本文以宁夏地区蛋鸡为研究对象，研究场区出现的坏死性肠炎疑似病例的病原及其针对性敏感药物，为鸡坏死性肠炎的临床防控提供参考数据。

关键词：坏死性肠炎;产气荚膜梭菌;临床防控

产气荚膜梭菌（又名魏氏梭菌）引起的坏死性肠炎是养禽业危害最大的疾病之一，尤其是饲料禁抗后，鸡坏死性肠炎作为一种“复燃疾病”给养禽行业带来了巨大挑战。关于肉鸡中魏氏梭菌的致病力、防控措施等都取得一定研究进展。但对于产蛋鸡饲养中魏氏梭菌的研究还较少。因此，笔者以宁夏地区蛋鸡场出现的坏死性肠炎疑似病例主要致病菌为研究对象，对宁夏地区蛋鸡场展开调查，以期为场区临床用药和防控提供一定参考方案。

1 方法

本研究将肠道剖检后采集到的肠内容物加入PBS溶液，涡旋震荡混匀后静置，吸取上清适量于FT液体培养基中，40℃厌氧培养16～24h。将增菌后的培养物充分摇匀，以超纯水进行不同浓度梯度稀释。用涂布棒依次按低浓度至高浓度顺序均匀涂布于制备好的平板上，待菌液充分吸收后覆盖一层TSC选择性培养基，40℃厌氧培养16～24h。选取疑似菌落接种于FT中培养16～24h，在产气荚膜梭菌的鉴定培养基上进一步分离纯化，经多次纯化培养后，进行革兰氏染色观察。将得到的培养物提取DNA，将其作为模板，利用通用引物进行PCR扩增。反应体系如下：2xPCR-Mix 10μL，模板2μL，10μmol/L上下游引物各0.8μL，补充ddH2O至总反应体系为20μL，后执行下列反应程序：95℃预变性5min;95℃变性45s;55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环;72℃延伸10min后结束反应。之后将回收纯化的PCR扩增产物进行序列测定，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用NCBI数据库将测序结果先进行BLAST程序比对，再从中选取相似性较高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 10.0软件构建系统发育树。将待测试药物稀释为相应的使用浓度，再用FT液体培养基将菌株复苏和培养16～24h。最后将高压灭菌后的牛津杯均匀放在下层琼脂平板上，LB-琼脂培养基与对数生长期的菌液均匀混合，凝固后于每孔中加入待测药物，设置对照孔，40℃厌氧培养16～24h。根据抑菌圈直径判定该菌株对测试药物的敏感性。

2 结果

在厌氧条件下，从鸡坏死性肠炎疑似病例中经FT液体培养基与TSC卵黄琼脂分离纯化，并经革兰氏染色观察可见两端钝圆、单排或双排形式的革兰氏阳性杆菌，并将分离菌株命名为XM21F。软件分析后表明测序得到的分离菌株序列与产气荚膜梭菌序列的同源性较高，构建系统发育树后显示XM21F与产气荚膜梭菌（clostridium perfringens）位于同一分支，表明分离菌为产气荚膜梭菌，进一步确定分离菌株的所属类别。药敏结果则显示分离菌株对阿莫西林、氨苄青霉素、地美硝唑、盐霉素、多西环素这5种药物高度敏感，对盐酸土霉素中度敏感，对硫酸新霉素、复方磺胺嘧啶、复方磺胺间甲氧嘧啶钠这3种药物耐药。

3 讨论

国内外当下普遍使用的魏氏梭菌鉴定方法即是采用PCR方法检测待测细菌毒素基因^[1]，本次研究将回收纯化的PCR扩增产物直接进行序列测定，经分析后确定为产气荚膜梭菌。产气荚膜梭菌（clostridium perfringens）引起的鸡坏死性肠炎是对养禽业危害最大的疾病之一，仅次于球虫对蛋鸡的危害，给蛋鸡行业造成巨大经济损失^[2]。伴随着抗生素的使用标准越来越严格，家禽坏死性肠炎的发病率呈逐年上升趋势^[3，4]。抗生素等药物已成为控制家禽产气荚膜梭菌感染的有效治疗措施^[5]。然而，由于抗生素耐药菌的出现和抗生素对微生物菌群的影响^[6]，使鸡产气荚膜梭菌产生了严重耐药性，为临床治疗时选择用药带来了巨大困难^[7]。文章对分离菌株--产气荚膜梭菌进行药敏实验，筛选出临床上对此治疗效果较显著的药物。结果显示，阿莫西林和氨苄青霉素等对产气荚膜梭菌具有良好的抑菌效果，而盐酸土霉素弱于阿莫西林与氨苄青霉素等药物，地克珠利与硫酸新霉素对该分离菌无明显抑制作用。根据文章研究结果来看，养殖场进行鸡坏死性肠炎防控时，可以优先进行病原的药敏实验，并根据结果选用高敏药物添加在饲料中，不仅能预防疾病，降低肠炎发病率，又可以减少场区经济损失，从而保证产蛋率，确保经济效益的最大实现。Gong等^[8]的研究指出植物乳杆菌与多黏菌拟杆菌通过改善肠道微生物群的组成和代谢途径、肠道结构等能够抗产气荚膜梭菌的感染。通过此次研究，也发现场区发生的肠炎疑似病例是在产蛋期时出现。对蛋鸡而言，产蛋期尤为关键，则对鸡坏死性肠炎的防控就显得尤为重要。因此，在对鸡坏死性肠炎进行整体防控时，可以多措并举，如在饲料中添加适量乳杆菌等制剂，同时注重饲养过程中的鸡群肠道发育，则对改善鸡群整体健康状况有良好的促进作用，其次处理好鸡舍环境卫生，规范消毒，合理调整饲养密度，及时通风换气，再用敏感藥物进行预防，就能够对坏死性肠炎病例达到一个有效的综合防控效果。

4 结论

从宁夏地区蛋鸡场坏死性肠炎疑似病例中分离到一株产气荚膜梭菌，对分离菌株进行体外药敏实验后，显示阿莫西林、氨苄青霉素、地美硝唑、盐霉素与多西环素对分离菌株有良好的抑制作用，而盐酸土霉素对分离菌株的抑制作用则弱于阿莫西林与氨苄青霉素等药物，硫酸新霉素、地克珠利与磺胺间甲氧嘧啶钠对分离菌株无抑制作用。

参考文献：

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*通訊作者